JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 4:19 min • February 2nd, 2026
Weź płytkę hodowlową z larwami Caenorhabditis , które przechowują interesujące bakterie kolonizujące ich światło jelit.
Na talerzu znajduje się znany szczep bakterii jako pożywienie. Głodzić robaki, aby zjadły wszystkie bakterie i weszły w stan uśpienia.
Dodaj podłoże i przelej robaki do rurki.
Wirówka i wyrzuć supernatant.
Dodaj roztwór detergentu, wymieszaj, aby usunąć bakterie przylegające do powierzchni, ponownie wiruj i wyrzuć supernatant.
Powtórz mycie, a następnie przelej dżdżownice na świeżą płytkę hodowlę.
Pozwól na pełzanie, aby usunąć luźno związane bakterie pokarmowe z powierzchni i światła jelit, zachowując jednocześnie te interesujące bakterie, które stabilnie kolonizują jelita.
Powtórz proces przenoszenia i raczkowania, aby zapewnić całkowite usunięcie bakterii pokarmowych.
Dodaj podłoże, przenieś robaki do szkła zegarkowego i rozciągnij, aby odsłonić jelita.
Rozciąń jelita zawierające interesujące się bakterie, zbierz je do rurek wypełnionych wodą i zamroz na przyszłe użycie.
Aby zagłodzić robaki i zmniejszyć liczbę bakterii OP50-1, inkubuj nicienie w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Dodaj 5 mililitrów medium M9 do płyty świeżo wygłodniałych robaków, a następnie przenosi nośniki M9 i robaki do sterylnej rurki wirówki o średnicy 15 milimetrów, aby przez 30 sekund w temperaturze pokojowej obracać się z prędkością 1000 g w temperaturze pokojowej.
Usuń supernatant przed pięciokrotnym myciem robaków 10 mililitrami M9 zawierającego 0,05% Triton X-100 na Nutatorze przez 20 minut. Po ostatnim przemyciu usuń supernatant bez naruszania pelletu w 100 mikrolitrach roztworu i przenieś M9 oraz robaki na nienasioną płytę NGM o średnicy 6 centymetrów. Pozwól wyschnąć talerzu, podczas gdy robaki będą się pełzać przez 20 minut, aby pomóc usunąć OP50-1 z kutikulki i jelita.
Gdy płytka wyschnie, powtórz procedurę, dodając 250 mikrolitrów M9 i przenosząc robaki na nową, nienasienną 6-centymetrową płytkę NGM, aby robaki mogły się pełzać podczas schnięcia płyty.
Po 20 minutach dodaj 250 mikrolitrów M9 na płytkę i przelej 100 mikrolitrów M9 wraz z robakami do czystej szklanki zegarkowej.
Następnie ścinaj nicienie igłą strzykawki 26, trzymając robaka inną igłą strzykawki 26.
Po odcięciu głowy jelito, ziarnista masa i przezroczysta gonad naturalnie oddalają się od ciała nicienia, następnie odcinają fragment odsłoniętego jelita i przenoszą pojedyncze rozcięte jelito do rurki PCR o pojemności 0,5 mililitra zawierającej 10 mikrolitrów sterylnej wody. Powtórz procedurę, aby pobrać jelita od co najmniej pięciu różnych zwierząt w probówkach PCR.
Zamroź rurki PCR w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na minimum 5 minut. Rozmroz próbki jelit przed przeprowadzeniem PCR i sekwencjonowania w celu identyfikacji.