Przygotowanie tkanek pęcherza myszy do wizualizacji infekcji bakteryjnej

Zacznij od uśpionej myszy z odsłoniętym pęcherzem, wcześniej zainfekowaną bakteriami patogennymi.

Bakterie wnikają do urotelu i tworzą kolonie. Po dojrzewaniu bakterie te przerywają komórkę nabłonkową i infekują otaczające komórki.

Wkładam cewnik podłączony do strzykawki wypełnionej utrwalaczem. Powoli wprowadzaj utrwalacz, aby nadmuchać pęcherz i zachować jego architekturę.

Zacisnąć cewkę moczową, aby zatrzymać utrwalacz i utrzymać kształt pęcherza.

Usuń cewnik, a potem przetnij cewkę moczową. Przełóż pęcherz na nowy utrwalacz i inkubuj, aby zachować strukturę.

Przedziel pęcherz na dwa półpęcherze kubków, aby odsłonić urothelium, i przepłucz buforem.

Bejcuj odczynnikiem na bazie metalu, aby poprawić kontrast, a następnie myj ultraczystą wodą.

Odwodnić odcinki za pomocą gradientu etanolowego, a następnie suszyć w punkcie krytycznym.

Przetnij każdy wysuszony kubek na pół.

Próbka jest już gotowa do dalszego przetwarzania w celu wizualizacji interakcji gospodarz-patogen.

Po umieszczeniu strzykawki z gruźlicy z utrwalaczem przymocuj cewnik na końcówkę, skośnie skierowaną naprzeciwko oznaczeń strzykawki.

Odetnij nadmiar rurki 1 do 2 milimetrów od końca igły, uważając, by nie odsłaniać końcówki igły. Strzykawkę przepchnij, aby usunąć pęcherzyki i naciśnij tłok, aby opróżnić powietrze. Następnie napełnij cewnik utrwalaczem nad rurką mikrowirówki. Po znieczuleniu i poświęceniu myszy, gdy nogi są zabezpieczone, otwórz okolicę miednicy myszy za pomocą kleszczy i chirurgicznych nożyczek, aby odsłonić pęcherz. Ostrożnie odsuwaj tłuszcz obok siebie, ale pęcherz zostaw na miejscu.

Trzymaj strzykawkę dominującą ręką, z igłą skierowaną w dół. Zanurz końcówkę cewnika w sterylnym smarze i umieść końcówkę cewnika przy otworze cewki moczowej, trzymając lufę strzykawki pod kątem 30 do 45 stopni nad ciałem myszy.

Naciskaj w dół z lekkim ruchem zgodnie z ruchem wskazówek zegara i delikatnie wprowadź cewnik do cewki moczowej. Gdy końcówka cewnika wchodzi, zawiasuj strzykawkę w stronę ogona myszy, jednocześnie przesuwając cewnik głębiej w cewkę moczową, aż lufka strzykawki będzie równoległa do powierzchni roboczej. Cały trzon igły cewnika powinien wejść do myszy, ustawiając końcówkę cewnika w lumencie pęcherza. Powoli podawaj 50 do 80 mikrolitrów utrwalacza, powodując napompowanie pęcherza jak balon.

Trzymaj cewnik na miejscu i lekko podnieś strzykawkę, unosząc końcówkę do góry. Drugą ręką otwórz hemostat i wsuń jeden kolc pod igłę cewnika w miejscu przecięcia cewki. Częściowo zamknij hemostat, aż tylko dotknie igły.

Delikatnie wyciągnij igłę cewnika z pęcherza, jednocześnie zaciskając i blokując hemostat, aby zapobiec utracie utrwalacza. Chwyć hemostat tak, aby był równoległy do powierzchni roboczej, z pęcherzem spoczywającym na górze. Podnieś delikatnie i ostrożnie przetnij pod hemostat, aby usunąć pęcherz z hemostatem nadal przymocowanym.

Włóż pęcherz i podłączony hemostat do rurki Falcon zawierającej podgrzany utrwalający środek. Upewnij się, że pęcherz jest całkowicie zanurzony w płynie i nie jest przyciśnięty do ścian rurki.

Aby obrazować pęcherz za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, przeciń go sagittally czystą, dwustronną żyletką lub skalpelem i wykonaj drugie cięcie styczne do hemostatu, aby uwolnić pęcherz. W efekcie powstają dwa półpęcherze na pęcherz. Jeśli na zewnątrz pęcherza są pozostałe poduszki tłuszczowe, delikatnie je usuń.

Przepłucz połówki pęcherza trzy razy buforem z kakodylanem sodu. Barw tkankę 1% czterotlenkiem osmu w buforze kakodylatowym o pojemności 0,15 mola przez godzinę w temperaturze pokojowej. Wykonaj ten krok, gdy naczynie barwiące jest owinięte folią, aby utrzymać ciemne otoczenie. Po zabarwieniu przepłucz połówki pęcherza trzy razy w ultraczystej wodzie.

Jeśli na powierzchni wody pojawi się olej osiem, zasysaj go lub odsunij, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas suszenia. Po odwodnieniu tkanki przeciń połówki pęcherza czystą, obstronną maszynką do golenia, aby uzyskać łącznie cztery kawałki.