Ocena przepuszczalności jelit u C. elegans po ekspozycji na bakterie

Weźmy C. robaki elegans hodowane na bogatych w składniki odżywcze płyty agarowe zawierające E. coli dla warunków kontrolnych oraz Pseudomonas aeruginosa dla stanu patogena.

Podczas inkubacji robaki żywią się bakteriami, które kolonizują światło jelit.

W grupie kontrolnej nabłonek jelit pozostaje nienaruszony, podczas gdy toksyny uwalniane przez patogeny powodują uszkodzenia nabłonka.

Przemyj robaki buforem i przenieś na płytki uzupełnione fluorescencyjnymi znacznikami oraz bakteriami nieaktywowanymi termicznie jako źródłem pożywienia.

W grupie kontrolnej spożyte fluorescencyjne znaczniki pozostają w jelitach, natomiast u patogenowych robaków przechodzą przez uszkodzone nabłonki i wchodzą do jamy ciała.

Ponownie umyj robaki i połóż je na świeżych talerzach. Następnie przenieś je na wielostudniową płytkę z utrwalaczem, aby zachować strukturę komórkową.

Usuń utrwalacz. Następnie dodaj medium mocujące do obrazowania.

Obserwuj za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego.

Zwiększona fluorescencja w jamie ciała P. Robaki narażone na Aeruginosę wskazują na przepuszczalność jelit wywołaną przez patogen.

Przemyj larwy L4 zsynchronizowane z wiekiem buforem S-buffer i przenieś około 500 robaków na płytki NGM zawierające różne bakterie i chemikalia. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Przygotuj płytki uzupełnione z FITC-dekstranem, mieszając 2 mililitry E inaktywowanego na gorąco. coli z czterema miligramami FITC-dekstranu. Dodaj 100 mikrolitrów tej mieszaniny na każdą z 20 świeżych płytek agarowych NGM i pozwól płytkom wyschnąć przez godzinę na czystym stole laboratoryjnym. Po 48 godzinach leczenia należy przemyć robaki buforem S, przenieść je na płytki uzupełnione z suplementacją FITC-dektranu oraz na płytki NGM bez FITC-dekstranu i inkubować płytki przez noc.

Następnego dnia umyj robaki buforem S i pozwól im wpełzać na świeżą płytę agarową NGM przez godzinę. Dodaj 50 mikrolitrów 4% formaldehydu do każdej dołki czarnej, 96-dołkowej, płaskiej płyty i przelej około 50 robaków do każdej studni. Po 1 do 2 minutach usuń cały formaldehyd i dodaj 100 mikrolitrów medium montażowego do każdego dołka.