An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion
JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:50 min • July 1st, 2026
Take an anesthetized mouse fasted overnight to reduce bowel movements.
Apply eye ointment to prevent corneal drying. Secure it on a heating pad to regulate body temperature.
Expose the right jugular vein. Insert a catheter and secure it with stitches.
Open the peritoneal cavity, then place the mouse on a transparent plate.
Spread the intestine to expose the mesenterium, a supportive membrane, to access the blood vessels.
Maintain body temperature and apply saline to prevent dehydration.
Place the mouse under a fluorescence microscope, then immobilize the vessels.
Apply an ionophore that elevates calcium levels in endothelial cells. This triggers the release of von Willebrand factor (VWF), forming coiled strands on the cell surface.
Inject fluorescently labeled bacteria through the catheter to reach the blood vessel.
The shear stress from blood flow uncoils the VWF strands, which bind to bacterial adhesins and form bacterial aggregates.
Capture time-lapse images to quantify shear-dependent bacterial adhesion.
Fast six to eight-week-old mice the night before the experiment to reduce bowel movement. The day of the experiment begin by injecting 0.1 milligrams of buprenorphine per kilogram of body weight as an analgesic. Next, anesthetize the mouse and apply ointment to the eyes.
Place the mouse on the thermo-controlled heating pad under the dissecting scope and test that the mouse shows no pedal reflex. Make a one-centimetre incision parallel to the jugular vein. Remove the right side of the cervical muscle and then isolate the jugular vein from the surrounding tissue.
Insert a two French intravenous catheter into the right jugular vein and secure it in place using stitches. Then, make a midline abdominal incision to open the peritoneal cavity. Place the mouse on its right side on a transparent plate and secure the cannula with tape.
Gently pull out the intestines using cotton swabs and spread the mesenterium to visualize the mesenteric arteriolar and venular circulation. Place a hot pack over the mouse to prevent hypothermia and drop 500 microliters of 0.9% NaCl on the intestines every 30 minutes to prevent dehydration of the tissue. Use cotton swabs to immobilize the vessels and visualize them under an inverted microscope.
Next, topically, apply five microliters of a 10 millimolar solution of calcium ionophore dissolved in DMSO. This will activate the release of von Willebrand factor from the endothelial cells in the vessels. After 10 seconds, inject 100 microliters of the fluorescently labeled bacteria through the jugular catheter. At this time, begin taking time-lapse images. Acquire time-lapse images using the acquisition tool in the toolbar, using 40 cycles of 1000 images per second. Once image acquisition is complete, euthanize the mouse according to institutional guidelines. Save the images in an appropriate image file format, and then process the images using ImageJ analysis software as previously described.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół in vivo do badania zależnej od ścinania adhezji bakterii do ściany naczynia w żywym modelu mysim. Metoda ta łączy przygotowanie chirurgiczne, kaniulację oraz obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i kwantyfikacji oddziaływań między czynnikiem von Willebranda (VWF) a bakteriami w fizjologicznych warunkach przepływu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia naczyniowa
- Obrazowanie in vivo
Wstęp
- Adhezja bakterii do ścian naczyń krwionośnych jest krytycznym etapem w patogenezie zakażeń krwi.
- Naprężenie ścinające wynikające z przepływu krwi wpływa na interakcje między bakteriami a powierzchniami śródbłonka.
- Czynnik von Willebranda (VWF) jest uwalniany z komórek śródbłonka i odgrywa rolę w pośredniczeniu w agregacji bakterii w warunkach przepływu.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt pozwala na poznanie tych dynamicznych procesów.
Cel badania
- Ustanowienie modelu in vivo do analizy adhezji bakterii do ścian naczyń w warunkach przepływu.
- Wizualizacja tworzenia się nici VWF oraz ich oddziaływania z bakteriami w czasie rzeczywistym.
- Ilościowe określenie zależnej od sił ścinania agregacji bakterii na powierzchniach śródbłonka.
Zastosowane metody
- Całodobowe posty i znieczulenie myszy w celu przygotowania do zabiegu chirurgicznego.
- Chirurgiczne odsłonięcie i kaniulacja prawej żyły szyjnej.
- Odsłonięcie naczyń krezkowych poprzez nacięcie brzucha i umieszczenie ich na przezroczystej płytce.
- Miejscowe zastosowanie jonoforu wapnia w celu indukcji uwalniania VWF z komórek śródbłonka.
- Wstrzyknięcie bakterii znakowanych fluorescencyjnie poprzez kaniulę.
- Mikroskopia fluorescencyjna w czasie rzeczywistym i akwizycja obrazów w odstępach czasu (time-lapse).
- Analiza obrazów przy użyciu oprogramowania ImageJ.
Główne wyniki
- Aplikacja jonoforu wapnia indukuje tworzenie nici VWF na powierzchniach śródbłonka.
- Naprężenie ścinające wynikające z przepływu krwi rozplątuje nici VWF, co ułatwia wiązanie i agregację bakterii.
- Obrazowanie fluorescencyjne umożliwia wizualizację i kwantyfikację zdarzeń adhezji bakteryjnej.
- Protokół pozwala na kontrolowane badanie zależnych od sił ścinania oddziaływań bakteryjno-śródbłonkowych in vivo.
Wnioski
- Ten model in vivo skutecznie demonstruje rolę naprężenia ścinającego oraz VWF w adhezji bakterii do ścian naczyń.
- Podejście to zapewnia platformę do badania interakcji między gospodarzem a patogenem w fizjologicznych warunkach przepływu.
- Można je zaadaptować do badania mechanizmów infekcji naczyniowych oraz oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zależna od sił ścinania adhezja bakteryjna jest krytycznym czynnikiem w patogenezie zakażeń naczyniowych i wpływa na wczesną walidację celów dla terapeutyków przeciwadhezyjnych. Ten model in vivo umożliwia kwantyfikację interakcji bakteria-śródbłonek w czasie rzeczywistym w warunkach przepływu fizjologicznego, co zwiększa pewność predykcyjną w zakresie redukcji ryzyka mechanistycznego. Podejście to wspiera decyzje dotyczące portfela badań poprzez wyjaśnienie dynamiki interakcji gospodarz-patogen istotnej dla przedklinicznych badań nad chorobami zakaźnymi.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów adhezji bakterii w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów, takich jak czynnik von Willebranda, w interakcjach między gospodarzem a patogenem.
- Zapewnia mechanistyczne zmniejszenie ryzyka w przypadku terapeutycznych strategii antyadhezyjnych.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w modelach chorób zakaźnych we wczesnej fazie badań.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ustanawia zwalidowany system in vivo do ilościowego określania zdarzeń adhezji bakteryjnej.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do dalszej analizy.
- Wspiera standaryzację testów do oceny potencjalnych interwencji celujących w szlaki adhezji.
- Umożliwia wiarygodne porównywanie szczepów bakteryjnych lub efektów terapeutycznych w kontrolowanych warunkach przepływu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami zakażeń naczyniowych istotnymi dla danej choroby w celu translacyjnego poszukiwania biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji środków przeciwprylistych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju portfeli leków na choroby zakaźne z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego w kontekście patogenezy zakażeń naczyniowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model obrazowania in vivo łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących adhezji bakteryjnej w warunkach przepływu.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia rolę naprężeń ścinających i VWF w adhezji bakteryjnej, wspierając testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego.
- Przesiew: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania do rozwoju testów i oceny kandydatów.
- Analityka: Generuje dane obrazowe w trybie poklatkowym dla rzetelnego porównania statystycznego zdarzeń adhezyjnych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia mechanistyczne z modelami infekcji naczyniowych istotnymi dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do różnych szczepów bakteryjnych i badań nad interwencjami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i walidację celów dla strategii antyadhezyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w obrazowaniu in vivo.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach programów dotyczących chorób zakaźnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój terapii antyadhezyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii małych zwierząt oraz w technikach obrazowania in vivo.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej i infrastruktury do ilościowej analizy obrazu.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności pozyskiwania i analizy danych.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych szczepów bakteryjnych i modalności interwencji poprzez optymalizację protokołu.
- Ograniczona do łożysk naczyniowych dostępnych dla obrazowania; może wymagać dostosowań specyficznych dla danego modelu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Model in vitro systemu perfuzyjnego z równoległymi płytkami do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
In Vitro Analiza Adhezji Bakteryjnej do Komórek Nabłonkowych Ssaków
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Model przepływu równoległego z płytkami in vitro do badania przyczepności bakteryjnej na biopsji tkanki
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Model jelit in vitro do oceny zrastów i internalizacji bakteryjnej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych SynVivo
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 22 sierpnia 2026