Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample
JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:32 min • July 1st, 2026
Take a soil extract containing bacteriophages, including Arthrobacter phages, pre-mixed with a growth medium.
Add Arthrobacter bacteria and incubate under agitation.
Arthrobacter phages attach to the bacterial surface and inject their DNA to produce new phages.
The host cells lyse to release progeny phages, enriching the medium with Arthrobacter phages.
Dilute this medium to reduce the phage concentration.
Add fresh Arthrobacter cells and calcium ions, which aid in phage infection.
Mix with a soft agar and pour onto a nutrient agar plate. The solidifying soft agar immobilizes the bacteria and restricts the phage spread.
Upon incubation, each phage infects a nearby host cell. It then produces progeny phages that infect neighboring bacteria, allowing localized infection.
The uninfected bacterial cells grow, while the infected bacterial cells lyse, detected as clear zones called plaques over a bacterial lawn.
These plaques contain progeny phages, ready for downstream use.
Begin this procedure by adding 1 to 2.5 milliliters of late exponential or early stationary phase bacteria culture to each of the flasks containing filter sterilized LB soil extract mixture. If the OD 600 of the culture is 0.5 to 0.7, use 1 milliliter. If the OD600 is higher than 0.7, use 2.5 milliliters.
Shake the flasks at 250 RPM at 30 degrees Celsius for approximately 24 hours in a shaking incubator. After the 24 hour incubation period, remove the enrichment flasks from the shaking incubator. Dilute the enrichment samples tenfold in phage buffer.
Set up culture tubes with 0.5 milliliters of late exponential or early stationary phase bacteria culture. Add various amounts from 5 microliters to 500 microliters of the diluted enrichment culture to the culture tubes.
Add calcium chloride to the culture tubes to make a final concentration in 5 milliliters equal to the concentration present in the original enrichment flask. Use a range of different calcium chloride concentrations to select for many phages with varying calcium chloride dependencies. Add 4.5 milliliters of LB top agar to each culture tube, and pour the mixture onto an LB agar plate.
Swirl gently to distribute evenly across the plate and allow the top agar to solidify for approximately 15 minutes. Invert the plates and incubate at 30 degrees Celsius overnight to 48 hours. Vary the incubation times to optimize for the phages present.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowaną technikę wzbogacania w celu izolacji gatunków bakteriofagów Arthrobacter z próbek gleby. Protokół łączy metody hodowli wzbogaconej i testu plackowego w celu amplifikacji, detekcji i izolacji fagów, które są wizualizowane jako przejrzyste strefy lizy na trawniku bakteryjnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Badania nad bakteriofagami
- Wirusologia środowiskowa
Wstęp
- Bakteriofagi to wirusy infekujące bakterie, które odgrywają kluczową rolę w ekologii drobnoustrojów.
- Gatunki Arthrobacter są powszechnymi bakteriami glebowymi i mają duże znaczenie dla badań środowiskowych.
- Izolowanie fagów z próbek środowiskowych wymaga zastosowania wydajnych technik wzbogacania i detekcji.
- Testy plackowe są standardową metodą wizualizacji i kwantyfikacji aktywności fagowej.
Cel badania
- Optymalizacja wzbogacania i izolacji fagów Arthrobacter z próbek gleby.
- Zaprezentowanie powtarzalnego protokołu amplifikacji i detekcji fagów z wykorzystaniem testu plackowego.
- Umożliwienie dalszych zastosowań z wykorzystaniem wyizolowanych fagów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie ekstraktu glebowego zawierającego bakteriofagi i zmieszanie go z pożywką wzrostową.
- Dodanie bakterii z rodzaju Arthrobacter i inkubacja przy mieszaniu w temperaturze 30°C przez 24 godziny.
- Rozcieńczenie wzbogaconej pożywki oraz dodanie świeżych komórek bakteryjnych i chlorku wapnia.
- Zmieszanie z miękkim agarem i wylanie na płytki z agarem odżywczym w celu przeprowadzenia testu plackowego.
- Inkubacja płytek w celu umożliwienia infekcji fagowej i powstania placków.
Główne wyniki
- Skuteczne wzbogacenie i amplifikacja fagów Arthrobacter z próbek gleby.
- Powstanie wyraźnych placków na trawnikach bakteryjnych, wskazujących na lokalną lizę indukowaną przez fagi.
- Optymalizacja stężeń chlorku wapnia w celu wyselekcjonowania fagów o różnym stopniu zależności od tego związku.
- Izolacja fagów potomnych z placków do dalszych badań.
Wnioski
- Zoptymalizowany protokół wzbogacania i testu plackowego skutecznie izoluje fagi Arthrobacter z gleby.
- Regulacja gęstości kultury bakteryjnej oraz stężenia chlorku wapnia zwiększa odzysk fagów.
- Metoda ta wspiera dalsze zastosowania w biologii fagów i mikrobiologii środowiskowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna izolacja bakteriofagów Arthrobacter z próbek środowiskowych umożliwia opracowanie niezawodnych narzędzi biologicznych do badań mikrobiologicznych i zastosowań biotechnologicznych. Procedura wzbogacania i testu plackowego zapewnia powtarzalną podstawę do wytwarzania dobrze scharakteryzowanych stoków fagów, co wspiera wczesne etapy odkryć i opracowywanie testów w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym. Zdolność ta jest kluczowa dla rozwoju technologii opartych na bakteriofagach oraz dla ograniczania ryzyka w procesach walidacji celów mikrobiologicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie oddziaływań bakteriofag-gospodarz w celu walidacji celów mikrobiologicznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolację fagów o zdefiniowanej swoistości względem gospodarza.
- Zwiększa pewność prognostyczną w późniejszych badaniach nad biologią fagów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Umożliwia otrzymywanie zwalidowanych zapasów fagów do ustandaryzowanych testów plackowych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki odczytu placków w celu optymalizacji testów.
- Wspiera skalowalne przepływy pracy w badaniach przesiewowych interakcji fag-bakteria.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia ciągłość procesu od izolacji fagów środowiskowych po opracowanie modelu przedklinicznego, w zależności od potrzeb.
- Wspiera zrównoważony pod kątem ryzyka postęp w selekcji kandydatów fagowych do dalszej charakterystyki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etap wczesnego odkrywania z opracowywaniem testów, dostarczając podstawowych banków fagów oraz wyników ilościowych do późniejszych analiz przesiewowych i badań mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących specyficzności faga względem gospodarza oraz dynamiki infekcji.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie powtarzalnych testów plackowych do porównawczej oceny aktywności fagów.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar stref lizy w celu porównania zakaźności fagów.
- Badania translacyjne: Tworzy podstawy do przekazania kandydatów na fagi do oceny przedklinicznej, pod warunkiem uzyskania dodatkowych danych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany protokół do powtarzalnej izolacji i charakterystyki fagów środowiskowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze faga i walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy wzbogacania i testów plackowych w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dotyczących dalszego rozwoju kandydatów fagowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację inicjatyw badawczych opartych na fagach z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza z zakresu mikrobiologii i biologii fagów.
- Wymagany dostęp do inkubatorów z wytrząsaniem, spektrofotometrów oraz infrastruktury do pracy w warunkach sterylnych.
- Wymagana standaryzacja warunków testu plackowego między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Może być konieczna adaptacja parametrów wzbogacania dla różnych próbek środowiskowych lub gospodarzy bakteryjnych.
- Zależność od optymalizacji stężeń chlorku wapnia oraz czasów inkubacji w celu maksymalizacji odzysku fagów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Usuwanie bakteriofagów z zakażonych kultur salmonelli
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja bakterii opornych na antybiotyki z próbki wody do analizy molekularnej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Przygotowanie kultury bakteryjnej glebowej pod kątem infekcji bakteriofagami
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Zoptymalizowana technika wzbogacania do izolacji gatunków bakteriofagów Arthrobacter z izolatów próbek gleby
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja i identyfikacja wodnych bakterii opornych na antybiotyki oraz charakterystyka molekularna ich genów oporności na antybiotyki
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026