Pomiar spontanicznej indukcji fagów w bakteriach lizogennych w czasie

Przygotuj kulturę bakterii lizogennej z nocnego hodowlania, w której większość komórek posiada uśpione DNA faga zintegrowane z ich genomem.

Zaszczepić w świeżym medium i inkubować.

Niektóre bakterie ulegają spontanicznej indukcji, wchodząc w cykl lityczny, podczas którego dochodzi do wycięcia i replikacji DNA faga oraz produkcji białek wirusowych.

Nowo zmontowane fagi infekcyjne są uwalniane poprzez lizę komórek.

Pobieraj próbki hodowli w określonych odstępach czasu.

Aby policzyć żywe, nieindukowane lizogeny, nanieś seryjne rozcieńczenia każdej próbki na płytkę agarową i inkubuj.

Policz kolonie, aby obliczyć liczba jednostek tworzących kolonie (CFU).

Aby policzyć infekcyjne fagi, nanieś te same rozcieńczenia na płytkę z agarem z antybiotykiem, uprzednio zaszczepioną opornymi na antybiotyki komórkami gospodarza wskaźnikowego. Ponieważ lizogeny są wrażliwe na antybiotyki, mogą rosnąć jedynie oporne komórki gospodarza.

Fagi infekują i lizują komórki, tworząc przejaśnienia.

Należy policzyć plamy, aby obliczyć jednostki tworzące plamy (PFU). Niższa liczba PFU wskazuje na mniejszą liczbę zdarzeń indukcji spontanicznej.

Przedstaw wykresy CFU i PFU w funkcji czasu. W wczesnej fazie wykładniczej wzrostu bakterii liczba PFU jest najniższa w stosunku do CFU, co wskazuje na minimalną spontaniczną indukcję fagów.

Aby rozpocząć, przygotuj świeże kultury lizogenu i gospodarza wskaźnikowego, szczepiąc kultury nocne w 100 ml LB w stosunku 1:100. Inkubuj w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 180 RPM.

Aby monitorować wzrost lizogenu, należy pobierać próbkę o objętości 1 mL co godzinę przez osiem godzin od momentu inokulacji. Kulturę należy rozcieńczać seryjnie, dodając 100 µL do 900 µL pożywki LB. Próbkę należy wymieszać w wirówce typu vortex z maksymalną prędkością, a następnie kontynuować serię rozcieńczeń od 10⁻¹ do 10⁻⁹.

Nanieś 10 µL odpowiedniego rozcieńczenia na płytkę z agarem LB. Pozostaw do wyschnięcia i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 18–24 h. Po inkubacji policz liczbę kolonii i oblicz liczbę żywych komórek bakteryjnych, korzystając z podanego wzoru.

Następnie, aby wyliczyć liczbę zakaźnych cząstek fagowych w próbce czasowej, dodaj 100 µL komórek gospodarza wskaźnikowego w fazie logarytmicznej, opornych na ryfampicynę, do roztopionego agaru wierzchniego, wraz z ryfampicyną. Nanieś 10 µL seryjnie rozcieńczonej kultury lizogenu na zaszczepioną warstwę agaru wierzchniego. Pozostaw do wyschnięcia, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 18 do 24 godzin.

Po inkubacji należy policzyć liczbę plaków i obliczyć liczbę zakaźnych cząstek fagowych, korzystając z podanego wzoru.