Transdukcja zapłodnionych zarodków szczura z wykorzystaniem wektora lentiwirusowego

Przygotować szalkę do mikroiniekcji z kroplą pożywki do hodowli embrionów w centrum, przykrytą olejem mineralnym w celu zapobiegania parowaniu.

Umieść szalkę pod mikroskopem odwróconym.

Umieść kapilarę do mikroiniekcji oraz pipetę trzymającą w układzie mikromanipulatora pod mikroskopem.

Kapilara do mikroiniekcji jest napełniana zawiesiną wektorów lentiwirusowych przenoszących transgen.

Następnie przenieś zapłodnione embriony szczura do medium.

Unieruchom embrion za pomocą pipety holdingowej, stosując ssanie.

Przy większym powiększeniu wprowadź kapilarę do mikroiniekcji przez pozakomórkową otoczkę glikoproteinową zarodka, czyli zonę pellucida, i wstrzyknij zawiesinę lentiwirusową do przestrzeni periwitellinej.

Następnie przenieś wstrzyknięte embriony do naczynia hodowlanego i inkubuj.

Wirus wnika do zarodka i uwalnia do cytoplazmy swój genom zawierający transgen.

Następnie ulega ono odwrotnej transkrypcji do DNA i integruje się z genomem embrionu, wprowadzając transgen.

Przetransdukowane embriony są teraz gotowe do dalszej obróbki.

W celu przeprowadzenia mikroiniekcji wektora lentiwirusowego pod błonę przejrzystą embrionów w stadium jednego komórki, należy użyć wyciągarki do pipet w celu przygotowania borokrzemowych kapilar szklanych do mikroiniekcji z użyciem włókna grzejnego. Po każdej wymianie włókna lub przy użyciu nowej kapilary szklanej należy przeprowadzić test Ramp, aby ustawić optymalne parametry.

Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, użyj końcówki mikroładownika, aby nanieść około 2 µL świeżo rozmrożonego roztworu lentiwirusa do każdej pipety do mikroiniekcji. Na środek pokrywki od 60 mm szalki Petriego nanieś kroplę 100 µL pożywki M2. Przykryj pożywkę olejem mineralnym, a następnie zamocuj pipetę trzymającą oraz kapilarę do mikroiniekcji załadowaną wirusem do mikromanipulatora.

Umieść naczynie do mikroiniekcji pod mikroskopem odwróconym i przenieś od 15 do 20 embrionów w stadium jednego komórki do kropli medium M2 w naczyniu do mikroiniekcji. Przechwyć jeden embrion za pomocą pipety trzymającej i przy użyciu 400-krotnego powiększenia oraz szklanej kapilary wstrzyknij roztwór lentiwirusowy pod zona pellucida do przestrzeni periwitellinowej, utrzymując kapilarę pod zona pellucida przez chwilę po dostarczeniu wirusa. Po wstrzyknięciu do wszystkich embrionów, za pomocą cienkiej pipety przenieś wstrzyknięte komórki z powrotem do naczynia hodowlanego i umieść je w inkubatorze do hodowli komórkowych do czasu ich implantacji.