Monitorowanie etapowej ekspresji genów wirusa vaccinia z użyciem reporterów fluorescencyjnych

Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej komórki ssaków poddane działaniu rekombinowanego wirusa szczepionkowego.

Rekombinowany wirus koduje zielone, czerwone i niebieskie białka fluorescencyjne, z których każde jest kontrolowane przez specyficzny dla danego etapu promotor, aby umożliwić śledzenie odpowiednio wczesnych, pośrednich i późnych etapów ekspresji genów.

Wirus wnika do komórki poprzez endocytozę zależną od receptorów i uwalnia swój rdzeń wirusowy do cytoplazmy.

Machina transkrypcyjna w rdzeniu wirusa napędza wczesną ekspresję genów, objawiającą się zieloną fluorescencją.

Białka wczesne pośredniczą w procesie odnowienia genomu, uwalniając wirusowe DNA do cytoplazmy, gdzie polimeraza DNA replikuje genom wirusa.

Następnie ekspresja genów pośrednich, sygnalizowana fluorescencją czerwoną, prowadzi do wytworzenia czynników transkrypcyjnych niezbędnych do aktywacji genów późnych.

Następnie ekspresja późnych genów, objawiająca się niebieską fluorescencją, prowadzi do syntezy białek strukturalnych niezbędnych do formowania dojrzałych wirionów.

Dodać utrwalacz i inkubować przez krótki czas, aby zachować fluorescencję.

Usunąć utrwalacz, a następnie dodać bufor.

Użyj spektrofotometru do p