Generowanie rekombinowanego wirusa RSV z tagiem GFP z wykorzystaniem systemu ekspresyjnego T7

Należy rozpocząć od mieszaniny plazmidów zawierającej plazmidy pomocnicze kodujące białka replikacyjne i transkrypcyjne RSV oraz oddzielny plazmid niosący pełną sekwencję cDNA antygenomu RSV ekspresyjnego dla GFP.

Każdy plazmid znajduje się pod kontrolą promotora T7.

Dodaj odczyn do transfekcji oparty na liposomach i inkubuj, aby umożliwić tworzenie się kompleksów.

Wprowadź te kompleksy do genetycznie zmodyfikowanych komórek nerki chomika wykazujących ekspresję polimerazy RNA T7 i inkubuj.

Kompleksy plazmidowe wnikają do komórek, gdzie polimeraza RNA T7 przepisuje plazmidy RSV.

W ten sposób powstają wirusowe mRNA kodujące białka replikacji i transkrypcji, a także powstaje antygenomiczne RNA RSV o polarności dodatniej.

Wykorzystując mechanizmy gospodarza, mRNA te produkują białka replikacyjne i transkrypcyjne wirusa, które tworzą funkcjonalny kompleks polimerazy RSV.

Kompleks polimerazy RSV przekształca następnie RNA o polarności dodatniej w genomiczne RNA wirusa.

To genomowe RNA kieruje syntezą wirusowych mRNA, które kodują białka strukturalne oraz GFP.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym zielona fluorescencja potwierdza ekspresję genów wirusa i rozpoczęcie produkcji rekombinowanego RSV.

Dzień