JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:35 min. • September 30th, 2026
Należy pobrać nadnadstawniki z kultur zawierające wiriony potomne uwalniane z komórek gospodarza zainfekowanych wariantem testowym HIV-1 lub kontrolą typu dzikiego.
Wirus testowy posiada wariant genu, który zmienia wydajność replikacji i wpływa na produkcję wirionów potomnych.
Dodaj nadsączki do mieszaniny do odwrotnej transkrypcji zawierającej znakowany radioaktywnie nukleotyd, nieznakowany nukleotyd, matrycę RNA, starter, kofaktory, detergent oraz stabilizatory.
Inkubować, aby umożliwić tworzenie kompleksu matryca–starter, podczas gdy detergent lizuje wiriony, uwalniając odwrotną transkryptazę (RT).
RT syntetyzuje DNA z kompleksu matryca–starter, włączając znakowany radioaktywnie nukleotyd.
Przenieś próbki na membranę wiążącą kwasy nukleinowe i wysusz na powietrzu, aby unieruchomić znakowany promieniotwórczo DNA.
Wielokrotnie płukać buforem i etanolem podczas mieszania, aby usunąć niezwiązane komponenty.
Wysuszyć membranę na powietrzu, a następnie ją zawinąć. Naświetlać membranę na ekranie czułym na promieniowanie i wykryć sygnały za pomocą fosforobrazownika.
Zmniejszony sygnał w próbie wskazuje na niższy poziom RT, co odzwierciedla zmniejszoną produkcję wirionów w porównaniu z kontrolą.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych