JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:53 min. • September 30th, 2026
Zacznij od komórek nabłonkowych zainfekowanych wirusem vaccinia i transfekowanych plazmidowym wektorem rekombinacyjnym.
Wektor niesie gen docelowy z zieloną fluorescencyjną znacznikową oraz gen selekcji metabolicznej z czerwoną fluorescencyjną znacznikową pod promotorem wirusowym.
Podczas replikacji wirusowego DNA kaseta plazmidowa zostaje wbudowana do genomu wirusa.
Zebrać komórki w pośrodku bezsurowiczym.
Zastosuj cykle zamrażania i rozmrażania, aby zlizować komórki i uwolnić wirusy.
Przygotować rozcieńczenia seryjne lizatu.
Zakaź świeże komórki nabłonkowe rozcieńczonym lizatem, aby uzyskać oddzielne, pojedyncze plaques.
Dodać medium zawierające surowicę w celu przeżycia komórek oraz odczyn do selekcji metabolicznej, a następnie inkubować.
Odczynnik selekcyjny hamuje enzymy biorące udział w syntezie nukleotydów. Tylko zakażone komórki posiadające gen selekcji metabolicznej wykazują ekspresję alternatywnego enzymu, który umożliwia syntezę nukleotydów, co pozwala im na przeżycie.
Usunąć pożywkę i obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Obecność fluorescencji zarówno czerwonej, jak i zielonej w płytce świadczy o pomyślnej integracji kasety i ekspresji genu docelowego.
Zainfekuj monowarstw
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych