Name: Zmodyfikowany test apoptozy jodku aneksyny V/propidyny w celu dokładnej oceny śmierci komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj zmodyfikowany protokół oceny śmierci komórki z użyciem aneksyny V i jodku propidyny. Metoda zmniejsza fałszywie pozytywne wyniki do 40% poprzez fiksację formaldehydem i degradację RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało sfinansowane z grantu badawczego Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) oraz grantu Alberta Agriculture Funding Consortium przyznanego DRB. AMR otrzymał wsparcie w ramach NSERC Vanier Canadian Graduate Scholarship, stypendium dla asystenta nauczania University of Alberta oraz stypendium dla doktorantów Queen Elizabeth II.

Tę procedurę można przeprowadzić w silikonizowanych probówkach o pojemności 500 μL lub polistyrenowych probówkach FACS z okrągłym dnem o pojemności 6 mL. Z tych drugich korzysta się zazwyczaj podczas przeprowadzania analizy żywotności w połączeniu z innymi procedurami. Wszystkie podane objętości dotyczą polistyrenowych probówek FACS z okrągłym dnem o pojemności 6 mL. W przypadku probówek silikonizowanych o pojemności 500 μL należy zmniejszyć wszystkie objętości pięciokrotnie.
Optymalne stężenie do analizy cytometrycznej jest wynikiem 2-4 x 106 komórek w objętości 200 μL. W wyniku tej procedury mogą wystąpić straty komórek, dlatego zalecamy, aby każda próbka na początku procedury zawierała 4 x 106 komórek.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Zbiór komórek – należy odnieść się do konkretnych procedur dla odpowiednich linii komórkowych lub izolacji komórek pierwotnych.</li>
	<li>Wirowanie próbek przy 335 x g przez 10 minut i odlanie nadsączu.</li>
	<li>Resuspensja komórek w 2 mL 1 x fosforanie buforze soli (PBS) -/- (bez wapnia, bez magnezu).</li>
	<li>Wirowanie próbek przy 335 x g przez 10 minut i odlanie nadsączu.</li>
	<li>Resuspensja komórek w 1 mL 1 x buforze wiążącym Annexin V.</li>
	<li>Wirowanie próbek przy 335 x g przez 10 minut i odlanie nadsączu.</li>
	<li>Resuspensja komórek w 100 μL 1 x buforze wiążącym Annexin V.</li>
</ol>
2. Zastosowanie barwienia Aneksyną V/PI
<ol>
	<li>Dodać Annexin V zgodnie z zaleceniami producenta [np. 5 μL Annexin V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].</li>
	<li>Inkubować probówki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do każdej probówki z reakcją dodać 100 μL 1 x buforu wiążącego Annexin V. W każdej probówce powinno znaleźć się około 200 μL.</li>
	<li>Dodać 4 μL PI (Sigma, Cat# P-4864-10ML) rozcieńczonego 1:10 w 1 x buforze wiążącym Annexin V (tj. 1 μL PI z 9 μL 1 x buforu wiążącego Annexin V). Pozwoli to uzyskać końcowe stężenie PI wynoszące 2 μg/mL w każdej próbce.</li>
	<li>Inkubować probówki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W celu przemycia komórek dodać 500 μL 1 x buforu wiążącego Annexin V.</li>
	<li>Wirować próbki z prędkością 335 x g przez 10 minut, a następnie odlać nadsącz.</li>
	<li>Resuspendować komórki w 500 μL 1 x buforu wiążącego Annexin V i 500 μL 2% formaldehydu, aby przygotować 1% roztwór formaldehydu (utrwalacza). Wymieszać zawartość probówek poprzez delikatne potrząsanie.</li>
	<li>Utrwalać próbki na lodzie przez 10 minut. Alternatywnie próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4°C w ciemności. W przypadku wyboru tej drugiej metody należy zachować spójność we wszystkich probówkach oznaczonych jako Annexin V/PI (łącznie z kontrolami kompensacji).</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 1 mL 1 x PBS-/- i delikatnie wymieszać poprzez potrząsanie.</li>
	<li>Wirować probówki z prędkością 425 x g przez osiem minut, a następnie odlać nadsącz.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.10 i 2.11.</li>
	<li>Resuspendować osad poprzez potrząsanie probówką.</li>
	<li>Dodać 16 μL RNazy A (Sigma, R4642) rozcieńczonej 1:100, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/mL. Inkubować przez 15 min w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Dodać 1 mL 1 x PBS-/- i delikatnie wymieszać poprzez potrząsanie.</li>
	<li>Wirować probówki z prędkością 425 x g przez osiem minut.</li>
	<li>Próbki są teraz gotowe do analizy. Alternatywnie próbki można wykorzystać w kolejnych etapach barwienia, jeśli barwienie Annexin/PI jest wykonywane równolegle z innymi procedurami.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Przykłady typów komórek i linii komórkowych wykazujących różny stopień fałszywie dodatniego barwienia PI przedstawiono na rysunku 1. Aby wyeliminować zdarzenia fałszywie dodatnie, komórki utrwalono, a następnie poddano działaniu RNazy A. Skutkuje to znacznym spadkiem liczby zdarzeń fałszywie dodatnich w porównaniu z komórkami, które nie zostały poddane traktowaniu RNazą (rysunek 2B). Rysunek 2C przedstawia reprezentatywne obrazy komórek poddanych działaniu RNazy w porównaniu z komórkami, których nie traktowano RNazą. Rysunek 3 pokazuje, w jaki sposób zmodyfikowany protokół Annexin V/PI, obejmujący etapy utrwalania i traktowania RNazą, usprawnia konwencjonalne protokoły poprzez ograniczenie liczby fałszywie dodatnich zdarzeń barwienia.
<img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="Test żywotności komórek; wyniki fałszywie dodatnie/prawdziwie dodatnie; mikroskopia fluorescencyjna; wyniki barwienia PI/DRAQ5." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Konwencjonalne protokoły barwienia jodkiem propidyny prowadzą do znacznej liczby wyników fałszywie dodatnich. Wcześniej oceniliśmy zakres barwienia fałszywie dodatniego w komórkach pierwotnych w szerokim zakresie modeli zwierzęcych, a także w różnych liniach komórkowych 10. Reprezentatywne obrazy pokazują zakres barwienia fałszywie dodatniego w trzech unikalnych populacjach komórek (jedna powszechnie stosowana linia komórkowa – makrofagi RAW oraz dwie komórki pierwotne – mysie makrofagi szpiku kostnego (BMM) i pierwotne makrofagi nerkowe złotej rybki (PKM)). Wyniki prawdziwie dodatnie wykazują oczekiwaną kolokalizację PI i DRAQ5 w obrębie jądra komórkowego (obszary żółte przedstawiają kolokalizację PI i DRAQ5). DRAQ5 jest barwnikiem o wysokiej przepuszczalności przez błony, który precyzyjnie barwi jądra zarówno w komórkach żywych, jak i martwych 10,11,12. W celu ułatwienia wizualnego określenia kolokalizacji, barwieniu DRAQ5 nadano zielony pseudokolor.
<img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="Wykresy porównawcze barwienia komórek i mikroskopia do analizy DNA; wpływ RNazy na PI/DRAQ5." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Poprawa dokładności jądrowego barwienia PI. (A) Oceńiono dokładność jądrowego barwienia PI na podstawie stopnia podobieństwa szeregu dobrze scharakteryzowanych barwników jądrowych (BrdU, 7-AAD i DAPI) do DRAQ5. BrdU jest syntetycznym nukleozydem, który wbudowuje się w DNA proliferujących komórek, a zatem barwi wyłącznie w obrębie przedziału jądrowego. 7-AAD wykazuje wysokie powinowactwo do DNA i, podobnie jak PI, nie może przekroczyć nienaruszonej błony plazmatycznej. DAPI również wykazuje silne powinowactwo do DNA i jest najczęściej stosowanym barwnikiem jądrowym w mikroskopii fluorescencyjnej. Stopień podobieństwa między BrdU, 7-AAD, DAPI a DRAQ5 wyniósł &gt;99%, co podkreśla ich zdolność do dokładnego barwienia jądra komórkowego w makrofagach RAW 264.7. W przeciwieństwie do tego, cytoplazmatyczne barwienie PI oparte na konwencjonalnych protokołach prowadzi do wyraźnego spadku procentowego podobieństwa barwienia w stosunku do DRAQ5. (B) Podobne wyniki zaobserwowano w dwóch badanych typach komórek pierwotnych: mysich makrofagach szpiku kostnego (BMM) oraz pierwotnych makrofagach nerkowych złotej rybki (PKM). Wprowadzenie 50 μg/mL RNazy A na konkretnym etapie procedury barwienia usuwa pozajądrowe barwienie PI i znacząco zwiększa stopień podobieństwa w stosunku do barwienia DRAQ5. (C) Reprezentatywne obrazy pierwotnych makrofagów nerkowych pokazują stopień podobieństwa komórek z zastosowaniem i bez zastosowania obróbki RNazą. Aby ułatwić wizualne określenie różnic między metodami, DRAQ5 oznaczono kolorem zielonym. Obszary żółte przedstawiają kolokalizację BrdU i DRAQ5 oraz PI i DRAQ5.
<img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej; apoptoza Annexin V-FITC/PI; wykresy ilustrują wpływ RNazy na żywotność komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Modyfikowany protokół Annexin V/PI znacząco redukuje liczbę fałszywie dodatnich zdarzeń apoptozy/nekrozy. Pierwotne makrofagi nerkowe złotej rybki (PKM) barwiono zgodnie z konwencjonalnym i zmodyfikowanym protokołem Annexin V/PI. Wykresy rozrzutu przedstawiają barwienie Annexin V/PI w PKM złotej rybki. Wykres po lewej stronie pokazuje konwencjonalne barwienie Annexin V/PI (bez RNazy) komórek PKM. Wykres po prawej stronie pokazuje komórki PKM barwione zmodyfikowanym protokołem Annexin V/PI (z RNazą). Dodatek RNazy skutkuje wyraźną redukcją barwienia PI dzięki usunięciu fałszywie dodatnich sygnałów. Następnie komórki PKM analizowano w oparciu o odrębne populacje w kulturach: wczesne progenitory (EP), monocyty (Mono) i dojrzałe makrofagi (Mat mac). Redukcja liczby zdarzeń dodatnich dla PI, wynikająca z usunięcia zdarzeń fałszywie dodatnich, jest bardziej wyraźna w dużych, dojrzałych komórkach makrofagów niż w mniejszych komórkach wczesnych progenitorów. Wnioski wyciągnięte na podstawie konwencjonalnych protokołów błędnie sugerowałyby pozytywną korelację między śmiercią komórkową a stopniem dojrzałości subpopulacji makrofagów.

<ol><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).</li>
<li>Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+expression+in+apoptotic+peripheral+blood+lymphocytes%3A+An+electron+microscopic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation.</a> Apoptosis. 7, 41-47 (2002).</li>
<li>Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytofluorometric+analysis+of+cell+cycle+distributions+using+propidium+iodide.+Properties+of+the+method+and+mathematical+analysis+of+the+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data.</a> J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).</li>
<li>Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+of+Annexin+V-binding+apoptotic+cells+is+highly+fragmented%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented.</a> Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 795-808 (1992).</li>
<li>Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+death%2Flife+regulator+in+apoptosis+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis.</a> Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).</li>
<li>Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+and+necrotic+cell+death+induced+by+death+domain+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors.</a> Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).</li>
<li>Faleiro, L., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+disrupt+the+nuclear-cytoplasmic+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier.</a> J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+apoptosis+assays+using+propidium+iodide+generate+a+significant+number+of+false+positives+that+prevent+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death.</a> J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).</li>
<li>Edward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Use+of+DNA-specific+anthraquinone+dyes+to+directly+reveal+cytoplasmic+and+nuclear+boundaries+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells.</a> Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).</li>
<li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół Annexin V/PI jest zmodyfikowaną wersją konwencjonalnych protokołów i uwzględnia obecność RNA w cytoplazmie, które również wykazuje wysokie powinowactwo do PI. Wprowadzenie RNazy A (50 μg/mL) po etapie utrwalania 1% formaldehydem w późnej fazie procedury barwienia znacząco poprawia dokładność barwienia jąder PI. Nie zaobserwowano negatywnego wpływu na barwienie jąder PI ani barwienie błony plazmatycznej Annexin V. Bez zastosowania RNazy A, nawet 40% wyników barwienia PI może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich, co może mieć znaczący i negatywny wpływ na dalsze wnioski10.
Nasz zmodyfikowany protokół barwienia Annexin V/PI jest prosty i był skutecznie stosowany w szerokim zakresie typów komórek (Komórki pierwotne: makrofagi szpiku kostnego i splenocyty mysie; komórki rezydentne płuc świń, makrofagi pęcherzykowe płuc, izolaty węzłów chłonnych krezkowych, leukocyty krwi obwodowej, splenocyty; komórki blastodermy kurczaka; pierwotne makrofagi nerek złotej rybki; leukocyty krwi obwodowej karpia; Linie komórkowe: makrofagi RAW 264.7, limfocyty T Jurkat, makrofagi świńskie 3D4/31, fibroblasty płetwy złotej rybki CCL-71, limfocyty B suma 3B11 10). Należy zauważyć, że komórki w różny sposób reagują na fałszywie dodatnie barwienie PI, przy czym komórki pierwotne zazwyczaj wykazują większą liczbę zdarzeń fałszywie dodatnich 10. Różnice w fałszywie dodatnim barwieniu PI pomiędzy tymi populacjami komórkowymi mogą wynikać częściowo z różnic w wielkości komórek, ale mogą być również rezultatem różnic w zawartości RNA. W związku z tym wdrożenie tej procedury jest szczególnie istotne dla systemów eksperymentalnych wykorzystujących między innymi komórki poddane stresowi genotoksycznemu, komórki traktowane lekami zatrzymującymi cykl komórkowy, takimi jak tymydyna lub hydroksymocznik, komórki zainfekowane wirusowo, a także w badaniach nad komórkami embrionalnymi, w których postęp rozwoju charakteryzuje się dyskretnymi zmianami w syntezie RNA komórkowego.

<table><tbody><tr><td>1 x PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x Bufor wiążący Anneksynę V</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Anneksyna V-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL w H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>2% Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td>Rozcieńczyć 1:60 w 1 x PBS-/-</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany test apoptozy z użyciem annexin v i jodku propidyny w celu dokładnej oceny śmierci komórek

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Badania nad apoptozą komórkową zostały znacząco usprawnione od czasu wprowadzenia metod opartych na cytometrii przepływowej. Jodek propidyny (PI) jest powszechnie stosowany w połączeniu z Aneksyną V w celu określenia, czy komórki są żywe, apoptotyczne czy nekrotyczne, poprzez analizę różnic w integralności i przepuszczalności błony plazmatycznej1,2. Protokół Aneksyna V/PI jest powszechnie stosowanym podejściem w badaniach komórek apoptotycznych3. PI jest używany częściej niż inne barwniki jądrowe, ponieważ jest ekonomiczny, stabilny i stanowi dobry wskaźnik żywotności komórek ze względu na zdolność do wykluczania barwnika w komórkach żywych 4,5. Zdolność PI do wnikania do komórki zależy od przepuszczalności błony; PI nie barwi komórek żywych ani we wczesnej fazie apoptozy ze względu na obecność nienaruszonej błony plazmatycznej 1,2,6. W komórkach w późnej fazie apoptozy oraz w komórkach nekrotycznych integralność błon plazmatycznych i jądrowych ulega zmniejszeniu7,8, co pozwala PI na przeniknięcie przez błony, interkalację do kwasów nukleinowych i emisję czerwonej fluorescencji 1,2,9. Niestety stwierdzono, że konwencjonalne protokoły Aneksyna V/PI prowadzą do znacznej liczby wyników fałszywie dodatnich (do 40%), które są związane z barwieniem przez PI RNA w kompartmencie cytoplazmatycznym10. Zjawisko to dotyczy komórek pierwotnych i linii komórkowych w szerokim zakresie modeli zwierzęcych, przy czym najwyższą częstotliwość występowania odnotowano w dużych komórkach (stosunek jądra do cytoplazmy &lt;0,5)10. W niniejszej pracy przedstawiamy zmodyfikowaną metodę Aneksyna V/PI, która zapewnia znaczną poprawę oceny śmierci komórkowej w porównaniu z metodami konwencjonalnymi. Protokół ten wykorzystuje zmiany w przepuszczalności komórkowej podczas utrwalania komórek, aby wspomóc wnikanie RNazy A do wnętrza komórek po barwieniu. Zarówno czas, jak i stężenie RNazy A zostały zoptymalizowane w celu usunięcia RNA cytoplazmatycznego. Wynikiem jest znacząca poprawa w stosunku do konwencjonalnych protokołów Aneksyna V/PI (&lt; 5% zdarzeń z cytoplazmatycznym barwieniem PI).

Opisano dokładną metodę oceny śmierci komórek. Protokół ten stanowi ulepszenie konwencjonalnych protokołów z użyciem Annexin V/jodku propidyny (PI), które wykazują do 40% wyników fałszywie dodatnich w liniach komórkowych i komórkach pierwotnych pochodzących z szerokiej gamy modeli zwierzęcych.

Zmodyfikowany test apoptozy z użyciem Annexin V i jodku propidyny w celu dokładnej oceny śmierci komórek

Badania nad apoptozą komórkową uległy znacznemu przełomowi po wprowadzeniu metod opartych na cytometrii przepływowej. Jodek propidyny (PI) jest powszechnie...

Ogólnym celem eksperymentu jest rozwiązanie bieżących problemów związanych z konwencjonalnymi technikami barwienia Aneksyną V i jodkiem propidyny w celu oceny śmierci komórkowej na drodze apoptozy i/lub nekrozy. Stwierdziliśmy, że konwencjonalne podejścia do barwienia szerokiego zakresu linii komórkowych i komórek pierwotnych prowadzą do wystąpienia do 40% wyników fałszywie dodatnich. Zdarzenia fałszywie dodatnie te wynikają z barwienia cytoplazmatycznego RNA.Z kolei nasz protokół drastycznie zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich poprzez wprowadzenie etapów fiksacji i degradacji RNA na określonych etapach. W procedurze barwienia najpierw komórki barwi się akrydyną pomarańczową i jodkiem propidyny w celu wykrycia śmierci komórkowej zgodnie z konwencjonalnymi procedurami. Następnie komórki utrwala się 1% formaldehydem, co zwiększa przepuszczalność błony plazmatycznej. Na koniec utrwalone komórki traktuje się RNazą A w celu degradacji RNA cytoplazmatycznego, co eliminuje barwienie jodkiem propidyny wywołujące wyniki fałszywie dodatnie.Podobnie jak wielu biologów komórkowych, stosowaliśmy konwencjonalne metody cytometrii przepływowej z użyciem aneksyny V i jodku propidyny do wykrywania apoptozy i nekrozy komórek. Niestety, niedawno odkryliśmy, że metoda ta prowadzi do znacznej liczby wyników fałszywie dodatnich, sięgających 40% w szeregu linii komórkowych i komórkach pierwotnych. Niniejsza zaktualizowana metoda pozwala uniknąć tych ograniczeń.Nasze podejście wykorzystuje utrwalanie komórek oraz trawienie RNA w określonych etapach procedury, aby selektywnie usunąć cytoplazmatyczne RNA, którego barwienie prowadzi bezpośrednio do wystąpienia wyników fałszywie dodatnich. Zbierz komórki przeznaczone do analizy w eksperymencie. W tym filmie wykorzystujemy surowe makrofagi. Przykładowo, odwiruj próbki z prędkością 335 Gs przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odlej nadsącz i ponownie zawieś komórki w 2 mL 1x PBS.Następnie ponownie przemyć komórki w tych samych warunkach. Tym razem resuspender komórki w 1 ml buforu wiążącego 1X NX i 5. Po odwirowaniu próbek i odlaniu supernatantu ponownie resuspender komórki do końcowej objętości 100 µL buforu wiążącego 1X NX i 5.Do każdej próbki komórek należy dodać odczynnik Xin five zgodnie z zaleceniami producenta. Na przykład w tym filmie do każdej polistyrenowej probówki z zaokrąglonym dnem dodawane jest 2.5 µL odczynnika Xin five zi. Probówki należy inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie do każdej probówki z reakcją należy dodać 100 µL 1X NX w buforze wiążącym 5. W każdej probówce powinno znajdować się teraz około 200 µL roztworu. Następnie należy przygotować rozcieńczenie jodku propidyny (PI) w stosunku 1:10 w 1X NX w buforze wiążącym 5. Do każdej probówki należy dodać 4 µL rozcieńczonego PI, aby uzyskać końcowe stężenie 2 µg/mL PI w każdej próbce.Ponownie inkubuj probówki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po tym okresie inkubacji przemyj komórki 500 µL 1X NX-5 binding buffer, a następnie wiruj próbki z prędkością 335 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odlej nadosad. Resuspenduj komórki w kolejnych 500 µL 1X NX-5 binding buffer wraz z 500 µL 2% formaldehydu.Aby przygotować 1% roztwór formaldehydu, wymieszaj zawartość probówek, delikatnie nimi potrząsając. Po utrwaleniu inkubuj próbki na lodzie przez 10 minut. Do każdej próbki dodaj 1 mL 1x PBS i wymieszaj delikatnie, potrząsając probówkami; podczas etapu płukania odwiruj komórki z prędkością 425 ×g przez 8 minut w temperaturze 4 °C, powtarzając tę czynność trzykrotnie.Przygotować rozcieńczenie RNA A w stosunku 1:100 w 1x PBS, resuspendować osad poprzez potrząsanie probówkami i dodać 16 µL roztworu rozcieńczonego RNA A, aby uzyskać stężenie końcowe 50 µg/mL. Następnie inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 37 °C. W kolejnym kroku przemyć komórki w 1 mL 1x PBS i delikatnie wymieszać poprzez potrząsanie, a następnie odwirować probówki z prędkością 425 ×g przez osiem minut w temperaturze 4 °C.Próbki są teraz gotowe do analizy. Alternatywnie, próbki mogą zostać wykorzystane w kolejnych etapach barwienia, jeśli barwienie N-X-M-P-I jest przeprowadzane równolegle z innymi procedurami. Reprezentatywne obrazy z cytometru przepływowego obrazującego pokazują zakres fałszywie dodatniego barwienia w trzech unikalnych populacjach komórek.Jedna powszechnie stosowana linia komórkowa makrofagów surowych oraz dwie pierwotne linie komórkowe odzwierciedlające makrofagi szpiku kostnego i pierwotne makrofagi nerek złotej rybki. Zastosowanie pierwotnych makrofagów złotej rybki podkreśla możliwość wykorzystania tej techniki w różnych platformach komórkowych. Zdarzenia prawdziwie dodatnie wykazują oczekiwaną kolokalizację PI i drac w obrębie przedziału jądrowego.Five, barwnik o wysokiej przepuszczalności błonowej, który precyzyjnie barwi przedział jądrowy komórek żywych i martwych, co potwierdza żółte zabarwienie. W niniejszym przypadku dokładność barwienia jądra za pomocą PI oceniono na podstawie stopnia podobieństwa do D dr five BRDU seven A.A D DPI, a DRAC five wykazały ponad 99% podobieństwa w zdolności do precyzyjnego barwienia jądra w linii komórkowej makrofagów raw 2 64 0.7. W przeciwieństwie do tego, cytoplazmatyczne barwienie PI, występujące przy stosowaniu konwencjonalnych protokołów, doprowadziło do wyraźnego spadku procentowego podobieństwa barwienia jądra w stosunku do d dr five.Na tej rycinie widać, że dodanie 50 µg/mL RNazy A eliminuje pozajądrowe barwienie PI i znacząco zwiększa stopień podobieństwa w stosunku do barwienia ddr5 w makrofagach szpiku kostnego myszy oraz pierwotnych makrofagach nerek złotej rybki. Reprezentatywne obrazy pierwotnych makrofagów nerek na tej rycinie pokazują zanik barwienia RNA w przedziale cytoplazmatycznym po zastosowaniu RNazy A. Przedstawione wykresy rozrzutu pierwotnych makrofagów nerek złotej rybki wykazują znaczną redukcję fałszywych zdarzeń apoptotycznych i nekrotycznych w komórkach przygotowanych zgodnie z zmodyfikowanym protokołem nexin PI.Nowy protokół wykazuje, że 84,9% komórek jest żywotnych. Bramki wyznaczono na podstawie równoległych próbek strumienia obrazów, które oceniają cechy fluorescencyjne i morfologiczne. W jednym przykładzie wczesne progenitory monocytów oraz dojrzałe makrofagi barwiono zmodyfikowanym protokołem NX w pięciu PI opisanym w tym filmie lub metodą konwencjonalną; w tym przypadku komórki barwione zmodyfikowanym protokołem wykazały wizualną redukcję liczby zdarzeń pozytywnych dla PI dzięki usunięciu zdarzeń fałszywie dodatnich poprzez zastosowanie RNazy.Ponadto efekt ten był bardziej wyraźny w dużych, dojrzałych makrofagach niż w mniejszych, wczesnych komórkach progenitorowych. Wnioski wyciągnięte na podstawie konwencjonalnych protokołów błędnie sugerowałyby pozytywną korelację w zakresie śmierci komórkowej dla bardziej dojrzałych subpopulacji makrofagów. Po przeprowadzeniu tej procedury barwienia można wykonać kolejne kroki, takie jak barwienie wewnątrzkomórkowe lub powierzchniowe, aby odpowiedzieć na konkretne pytania dotyczące subpopulacji w izolacie komórek. Znaczenie tej techniki wykracza poza zagadnienia związane z odpornością; jest ona na przykład istotna dla systemów eksperymentalnych wykorzystujących komórki poddane stresowi genotoksycznemu, komórki traktowane lekami hamującymi cykl komórkowy, takimi jak tymidyna lub hydroksymocznik, a także w badaniach nad komórkami embrionalnymi, w których progresja rozwojowa charakteryzuje się dyskretnymi zmianami w syntezie RNA komórkowego.

modified-annexin-vpropidium-iodide-apoptosis-assay-for-accurate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zmodyfikowany test na apoptozę Annexin V/Propidium Iodide dla dokładnej oceny obumierania komórek

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Ten film demonstruje metodę barwienia jądrowego w celu wykrycia cytotoksycznego wpływu mitokanu na wrażliwe na leki komórki nowotworowe i zdrowe warianty. Podwójne barwienie barwnikami wiążącymi DNA, takimi jak jodek propidyny i barwnik Hoechsta, zapewnia wyraźne rozróżnienie między martwymi i żywymi komórkami, pomagając w ten sposób ocenić cytotoksyczność leku.

Różnicowy test barwienia jądrowego: Test mający na celu określenie cytotoksyczności mitokanu za pomocą jodku propidyny i podwójnego barwienia Hoechst

W tym filmie pokazujemy test wiązania Aneksyny V do pomiaru stopnia eryptozy, zaprogramowanej śmierci komórki erytrocytów, za pomocą barwienia fluorescencyjnego Aneksyny V. Erytrocyty apoptotyczne wykazują translokację fosfatydyloseryny z wewnętrznej do zewnętrznej płatki błony komórkowej, powodując wiązanie się znakowanej fluoroforem aneksyny V z translokowaną fosfatydyloseryną, emitując w ten sposób sygnał fluorescencyjny.

Test wiązania aneksyny V: technika oparta na fluorescencji do identyfikacji erytrocytów apoptotycznych poprzez znakowanie fosfatydyloseryną

Związki terapeutyczne są często najpierw badane in vitro za pomocą testów żywotności. Zliczanie ślepych komórek przez ludzkiego obserwatora może być bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany liczby komórek, ale nie ocenia funkcji. Komputerowe testy żywotności, jak opisano tutaj, mogą ocenić zarówno strukturę, jak i funkcję w obiektywny sposób.

Testy żywotności komórek w hodowli

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Opracowany jest przepływ pracy wykorzystujący cytometrię przepływową lub wirowanie różnicowe do wykrywania, ilościowego oznaczania i izolowania ciał apoptotycznych z próbki apoptotycznej do wysokiej czystości.

Wykrywanie i izolacja ciał apoptotycznych do wysokiej czystości

Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

Apoptozę można scharakteryzować za pomocą analizy cytometrycznej wczesnych i późnych biomarkerów apoptozy. Linię komórkową raka szyjki macicy, SiHa, analizowano pod kątem biomarkerów apoptozy po leczeniu aktynomycyną D przy użyciu laboratoryjnego cytometru przepływowego.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D

Pyrosequencing(R) jest jedną z najbardziej szczegółowych, a zarazem prostych metod stosowanych obecnie do analizy polimorfizmów. Metoda ta umożliwiła szybką i efektywną ocenę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu, w tym wielu polimorfizmów o istotnym znaczeniu klinicznym. W materiale wyjaśniono technikę oraz metodologię Pyrosequencing.

Pirosekwencjonowanie: prosta metoda dokładnego genotypowania

Poznaj zmodyfikowany protokół oceny śmierci komórki z użyciem aneksyny V i jodku propidyny. Metoda zmniejsza fałszywie pozytywne wyniki do 40% poprzez fiksację formaldehydem i degradację RNA.

Zmodyfikowany test apoptozy z użyciem Annexin V i jodku propidyny w celu dokładnej oceny śmierci komórek

Przeglądaj więcej filmów