Name: Obrazowanie bioluminescencyjne w celu oceny odpowiedzi immunologicznej po implantacji zmodyfikowanej tkanki serca (EHT) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania bioluminescencyjnego do monitorowania odpowiedzi immunologicznej po implantacji inżynierskiej tkanki serca (EHT) u szczurów. Technika umożliwia długoterminową ocenę przeżycia przeszczepu i mechanizmów odrzucenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sonja Schrepfer, Lenard Conradi oraz Arne Hansen otrzymali finansowanie z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1). Praca była również wspierana przez granty z Unii Europejskiej przyznane Thomasowi Eschenhagenowi (EUGeneHeart oraz Angioscaff).

1. Generowanie EHT i warunki hodowli
Wytwarzanie EHT na bazie fibryny przeprowadzono zgodnie z opisem przedstawionym w innym opracowaniu 4. W skrócie, aby wytworzyć EHT na bazie fibryny do celów implantacji, przygotowano mieszaninę główną (master mix) zawierającą komórki izolowane z serc noworodkowych transgenicznych szczurów ROSA/luciferase-LEW, fibrynogen bydlęcy oraz Matrigel. Formy odlewnicze z agarozy przygotowano, używając teflonowych przekładek umieszczonych w 6-dołkowych naczyniach hodowlanych. Po zestaleniu agarozy przekładki usunięto, a na naczyniach hodowlanych umieszczono silikonowe stelaże z trzpieniami wnikającymi do form. Aby wytworzyć EHT, mieszaninę główną krótko zmieszano z obliczoną ilością trombiny i naniesiono pipetą do formy. Po polimeryzacji fibrynogenu silikonowe stelaże z przylegającymi do trzpieni EHT ostrożnie wyjęto z form odlewniczych z agarozy, przeniesiono do nowych 6-dołkowych naczyń do hodowli komórek i inkubowano w temperaturze 37°C i 7% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek, stosując specjalnie przygotowaną pożywkę hodowlaną.
Tkanki sercowe inżynieryjnie wytworzone (EHT) utrzymywano w warunkach hodowli komórkowej do dziesiątego dnia. W tym czasie neonatalne komórki serca szczura zaczęły się wydłużać, łączyć i układać wzdłuż linii sił między silikonowymi słupkami. W momencie implantacji zaobserwowano spontaniczne, spójne skurcze, które powodowały odchylenie silikonowych słupków.
2. Implantacja EHT
Implantację EHT przeprowadzono u szczurów Brown Norway (BN) o zachowanej odporności lub u immunodeficientnych szczurów nagich w celu zbadania allogenicznej odpowiedzi immunologicznej. Szczury BN i nagie o masie 100 - 150 g zakupiono w Charles River Germany (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) i utrzymywano w konwencjonalnych warunkach, podając standardową karmę dla szczurów oraz wodę ad libidum. Szczury immunodeficientne utrzymywano w sterylnej ściółce i klatkach, a do pojenia używano sterylnej wody. Procedury dotyczące zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez niemiecką komisję etyczną. Wszystkie instrumenty chirurgiczne poddano sterylizacji przed użyciem.
Procedurę implantacji przeprowadza się w następujący sposób:
Szczury są znieczulane izofluranem (2,5-3%) przy użyciu komory indukcyjnej. Ekspozycję ludzi na izofluran można ograniczyć, pracując przy stole z wyciągiem dolnym lub w dygestorium bez recyrkulacji. Podczas procedury chirurgicznej utrzymywana jest temperatura ciała.
<ol>
	<li>Wygolić obszar brzucha i nałożyć maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu oczu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Położyć szczura na plecach i założyć maskę na nos i pysk, aby podtrzymać znieczulenie.</li>
	<li>Zdezynfekować obszar brzucha, używając Betadinu, a następnie 80% etanolu. Przetrzeć od miejsca czystego do brudnego, od centrum wygolonego obszaru na zewnątrz, w kierunku obszaru owłosionego.</li>
	<li>Sprawdzić odruchy, uszczypiając tylne łapy, aby upewnić się, że szczur jest odpowiednio znieczulony.</li>
	<li>Założyć sterylne pole i wykonać cięcie w linii środkowej brzucha, oddzielając skórę i mięśnie w dwóch etapach w celu otwarcia jamy brzusznej. Pomiędzy otwarciem skóry a mięśni stosuje się sterylizację gorącym koralikiem.</li>
	<li>Umieścić jelita w ogrzanej soli fizjologicznej wewnątrz rękawiczki bezpudrowej. Zwinąć rękawiczkę wokół jelit, aby zapobiec utracie wilgoci.</li>
	<li>Usunąć tkankę tłuszczową i odsłonić śledzionę.</li>
	<li>Zlokalizować i rozsunąć siecią większą za pomocą pęsety.</li>
	<li>Ostrożnie odciąć EHT od podtrzymujących słupków silikonowych i przenieść na siecią większą.</li>
	<li>Owinąć siecią większą wokół EHT i przymocować za pomocą dwóch pojedynczych szwów z Prolene 7-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).</li>
	<li>Następnie przenieść jelita z powrotem do jamy brzusznej.</li>
	<li>Przepłukać jamę brzuszną uprzednio ogrzaną sterylną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Zamknąć warstwę mięśniową ściany brzucha, używając ciągłych szwów z Prolene 6-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).</li>
	<li>Użyć ciągłych szwów z Prolene 5-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy) do zamknięcia skóry.</li>
	<li>Gdy szczur nadal znajduje się pod wpływem znieczulenia, wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg Karprofenu.</li>
	<li>Aby zapewnić wystarczającą analgezję przy tego typu zabiegu, do wody pitnej dodaje się lek przeciwbólowy (taki jak Metamizol) (50 mg Metamizolu na 100 ml) w celu leczenia bólu przez 3 dni po transplantacji.</li>
</ol>
3. Obrazowanie bioluminescencyjne EHT po implantacji
Platforma obrazowania biologicznego IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA) jest wykorzystywana do nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego in-vivo, a wyniki są analizowane przy użyciu pakietu oprogramowania IVIS Living Image (Xenogen). Obrazowanie jest przeprowadzane codziennie, zaczynając od 2 godzin po zabiegu operacyjnym.
Zanurz szczura w narkozie z użyciem izofluranu (2,5 - 3%) w komorze indukcyjnej.
<ol>
	<li>Szeroko zdezynfekuj obszar brzucha i klatki piersiowej za pomocą Provo-Iodine, następnie użyj 80% etanolu; powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Wstrzyknij d-lucyferynę (Xenogen; 375 mg/kg masy ciała) do opłucznej brzusznej (i.p.).</li>
	<li>Umieść znieczulone szczury w komorze obrazowania IVIS (jednocześnie można analizować do 4 szczurów).</li>
	<li>Oceń natężenie sygnału komórek luc+ wewnątrz EHT w jednostkach photons/sec/cm2/steridian w obszarze zainteresowania (ROI) w punkcie wyjściowym (120 minut po implantacji) oraz w dniach 1, 2, 3, 5, 7, 10 oraz w tygodniach 2, 3 i 4. Odnotuj sygnał szczytowy (pojawia się około 20 minut po wstrzyknięciu d-lucyferyny).</li>
</ol>
Utwórz wykres (Excel) przedstawiający intensywność sygnału w czasie.
4. Korelacja wyników BLI i ELISPOT
Komórkowe odpowiedzi immunologiczne in-vivo u szczurów BN immunokompetentnych oraz szczurów nago immunodeficientnych badano po transplantacji EHT. Śledziony zwierząt biorców pobrano 5 dni po transplantacji EHT w celu izolacji splenocytów biorcy. Testy Elispot, w których jako stymulator wykorzystano EHT zahamowane mitycyną (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), a jako komórki odpowiadające 5 x106 splenocytów biorcy, przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta (BD Biosciences), używając płytek pokrytych IFN-γ oraz IL-4 w celu zbadania odpowiednio odpowiedzi TH1 oraz TH2. Liczba plamek IFN-γ oraz IL-4 była znacząco wyższa w modelu immunokompetentnym w porównaniu z modelem immunodeficientnym (IFN-γ: p= 0.001; IL-4: p=0.023; test t Studenta).
5. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="Schemat ELISpot i wykres zaniku fotonów po transplantacji EHT." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Korelacja wyników BLI i ELISPOT a) Badano komórkowe odpowiedzi immunologiczne in vivo u immunokompetentnych szczurów rasy Brown Norway oraz niedoborowych szczurów nago po implantacji EHT. Splenocyty biorców pobrano 5 dni po implantacji EHT. Ekspresję IFNγ oraz IL-4 oceniono za pomocą testów ELISpot, stosując EHT zahamowane mitycyną jako stymulatory oraz 5x106 splenocytów biorcy jako komórki odpowiadające. Odpowiedzi Th1 i Th2 były znacznie wyższe w modelu immunokompetentnym w porównaniu z modelem niedoborowym, co potwierdzono odpowiednio poprzez produkcję IFNγ i IL-4. b) Luc+ EHT przeszczepiono do sieci większej sieci u immunokompetentnych szczurów BN lub niedoborowych szczurów nago. Przeżywalność komórek monitorowano podłużnie za pomocą BLI. Przedstawiono odsetek zwierząt, które odrzuciły przeszczepione EHT. Wszystkie szczury BN szybko odrzuciły przeszczepy EHT, podczas gdy komórki przeżyły u szczurów z niedoborem limfocytów T.

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przed wdrożeniem klinicznym technologii EHT w celu naprawy serca, w modelach eksperymentalnych należy ocenić fundamentalne kwestie, takie jak immunogenność zarówno komponentów komórkowych, jak i macierzy, oraz przeżywalność przeszczepu po implantacji. Obrazowanie bioluminescencyjne in-vivo stanowi przydatną, nową technikę monitorowania przeżywalności komórek po transplantacji. Poprzez adaptację uznanego protokołu 4 pomyślnie wytworzyliśmy EHT na bazie fibryny zawierające komórki serca dodatnie pod kąt...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;li&gt;szczury LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk (numer szczura NBPR 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;fibrynogen bydlęcy (roztwór zapasu: 200 mg/ml z dodatkiem aprotyniny 5 &amp;#x03BC;g/ml fibrynogenu w 0,9% NaCl (Sigma F4753)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Matrigel (BD Bioscience 356235)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DMEM (Biochrome F0415)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Surowica konia (Gibco 26050)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Penicylina/streptomycyna (Gibco 15140)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Insulina (Sigma-Aldrich I9278)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Aprotynina (Sigma Aldrich A1153)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;d-lucyferyna (Biosynth L-8220)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Płytki do testu ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot) (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

obrazowanie bioluminescencyjne do oceny odpowiedzi immunologicznej po implantacji inżynieryjnej tkanki serca (eht)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

W ciągu ostatnich dziesięcioleci rozwijano różne techniki inżynierii tkanki serca, w tym strategie wykorzystujące materiały rusztowaniowe naturalne lub bioartystyczne, unieruchamianie miocytów serca w hydrożelach, takich jak fibryna lub kolagen, a także nakładanie warstw monowarstw miocytów 1. Koncepcje te mają na celu przywrócenie upośledżonej funkcji serca (np. po zawałe mięśnia sercowego) lub służą jako modele eksperymentalne (np. w toksykologii predykcyjnej, przesiewaniu substancji lub modelowaniu chorób). Dzięki zastosowaniu technik obrazowania bioluminescencyjnego in-vivo (BLI) możliwe stało się obecnie precyzyjne monitorowanie przeżywalności komórek po implantacji inżynieryjnej tkanki serca (EHT) 2. W niniejszej pracy opisujemy wytwarzanie EHT na bazie fibryny z transgenicznej linii szczurów z powszechną ekspresją lucyferazy świetlika (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantację wykonuje się w sieci większą różnych szczepów szczurów, aby ocenić odpowiedzi immunologiczne organizmu biorcy po wszczepieniu EHT. Porównanie wyników uzyskanych za pomocą BLI oraz techniki Enzyme Linked Immuno Spot (ELISPOT) potwierdza przydatność BLI do oceny odpowiedzi immunologicznych.

Niniejszy film prezentuje zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego in vivo do badania odpowiedzi immunologicznych po implantacji sztucznie wyhodowanej tkanki serca (EHT) u szczurów.

Obrazowanie bioluminescencyjne do oceny odpowiedzi immunologicznej po implantacji inżynieryjnej tkanki serca (EHT)

W ciągu ostatnich dziesięcioleci rozwijano różnorodne techniki inżynierii tkankowej serca, w tym strategie wykorzystujące rusztowania oparte zarówno na naturalnych, jak i...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego in vivo do badania odpowiedzi immunologicznej po implantacji zmodyfikowanej tkanki serca (EHT) u szczurów. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wygenerowanie EHT wykazujących aktywność lucyferazy. Następnie EHT stabilnie ekspresujące lucyferazę są transplantowane do sieci większej szczurów biorców.Następnie u zwierząt biorców można przeprowadzić obrazowanie bioluminescencyjne in vivo w celu nieinwazyjnego, podłużnego monitorowania przeżycia i odrzucenia przeszczepu serca (EHT). Wykorzystując ten model, można na przykład skorelować intensywność i kinetykę ostrego odrzucenia ze spadkiem obserwowanej intensywności sygnału bioluminescencyjnego w czasie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak histologia, jest możliwość codziennych pomiarów, co pozwala na nieinwazyjną podłużną ocenę przeżycia przeszczepu.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat przeżywalności i odrzucania zmodyfikowanych tkanek serca, ale można ją również zastosować do badania innych zagadnień, na przykład metabolizmu ehs. Technikę bili zaprezentuje Christiana Parman, która wykonuje tę pro

bioluminescence-imaging-for-assessment-immune-responses-following

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu oceny odpowiedzi immunologicznej po implantacji zmodyfikowanej tkanki serca (EHT)

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

Przedstawiono procedurę chirurgicznego wprowadzenia komórek śródbłonka pochodnych z embrionalnych komórek macierzystych do niedokrwionej kończyny dolnej, z zastosowaniem nieinwazyjnego śledzenia za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Komórki śródbłonka pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych w leczeniu niedokrwienia kończyny dolnej

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Opisano metodę śledzenia fuzji komórek w żywych organizmach w czasie. Podejście to wykorzystuje rekombinację Cre-LoxP do indukcji ekspresji lucyferazy po fuzji komórek. Wygenerowany sygnał luminescencyjny może być wykrywany w żywych organizmach przy użyciu systemów obrazowania biofotonicznego z czułością detekcji na poziomie ˜1,000 komórek w tkankach obwodowych.

Podejście oparte na rekombinacji Cre-Lox P do detekcji fuzji komórek in vivo

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Komórki ssaków wyrażające kasetę genu bioluminescencji bakteryjnej (luksy) wytwarzają światło autonomicznie. Wykazano, że uzyskana dynamika bioluminescencyjna po ekspozycji chemicznej odzwierciedla wpływ leczenia na wzrost i metabolizm komórek, dzięki czemu komórki te są niedrogim, ciągłym narzędziem do badań przesiewowych toksyczności w czasie rzeczywistym, które można łatwo dostosować do automatyzacji o wysokiej przepustowości.

Autonomicznie bioluminescencyjne komórki ssaków do ciągłego monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym

Implantacja biogramu do leczenia zawału mięśnia sercowego wywołanego podwiązaniem LAD w modelu gryzoni tradycyjnie wymagała dwóch operacji na otwartym sercu. W celu zmniejszenia śmiertelności i zapewnienia optymalnych warunków do utrwalania stałych i galaretowatych biomatryc związanych z komórkami, opracowano procedury małoinwazyjne.

Terapia komórkowa niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w przypadku zawału mięśnia sercowego i implantacji nasierdzia komórek i biomatrycy

Tutaj przedstawiamy metodę użycia wewnątrzkomorowego cewnika optycznego w perfundowanych sercach do wykonywania spektroskopii absorbancji przez ścianę serca. Uzyskane dane dostarczają solidnych informacji na temat napięcia tlenu w tkankach, a także wykorzystania substratu i potencjału błonowego jednocześnie z pomiarami wydolności serca w tym wszechobecnym preparacie.

Wewnątrzsercowy cewnik świetlny do bocznego zapłonu do monitorowania metabolizmu komórkowego za pomocą przezściennej spektroskopii absorpcji perfundowanych serc ssaków

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanego protokołu wstrzykiwań domięśniowych pod kontrolą echokardiografii w szczurzych modelach zawału mięśnia sercowego przy użyciu igły 29 G x 88 mm. Technika ta zapewnia solidne, precyzyjne i powtarzalne dostarczanie środków terapeutycznych bezpośrednio do strefy okołozawałowej.

Iniekcja pod kontrolą echokardiografii w celu ukierunkowanego i niezawodnego dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego w szczurzym modelu zawału mięśnia sercowego

Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania bioluminescencyjnego do monitorowania odpowiedzi immunologicznej po implantacji inżynierskiej tkanki serca (EHT) u szczurów. Technika umożliwia długoterminową ocenę przeżycia przeszczepu i mechanizmów odrzucenia.

Obrazowanie bioluminescencyjne do oceny odpowiedzi immunologicznej po implantacji inżynieryjnej tkanki serca (EHT)

Przeglądaj więcej filmów