iCLIP - Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością poszczególnych nukleotydów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie szerokiej mapy transkryptomu miejsc wiązania białka wiążącego RNA w rozdzielczości poszczególnych nukleotydów. Osiąga się to poprzez naświetlanie żywymi komórkami promieniowaniem UV w celu kowalencyjnego sieciowania białek i RNA in vivo w drugim etapie. Białko wiążące RNA jest oczyszczane immunologicznie w rygorystycznych warunkach w celu odzyskania usieciowanych fragmentów RNA.

Następnie odwrotna transkrypcja generuje CDNA, które często skracają się do dołączonego peptydu, który zachowuje informacje o pozycji usieciowania w RNA Uzyskuje się wyniki, które pokazują wszystkie miejsca wiązania w transkryptomie w oparciu o sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości biblioteki cDNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii RNA, takie jak to, w jaki sposób wzajemne oddziaływanie różnych białek onowych RNA reguluje przetwarzanie RNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że zwiększamy zarówno wydajność, jak i rozdzielczość naszych szerokich map transkryptomu oddziaływań białkowych RNA, aby rozpocząć procedurę sieciowania komórek tkankowych promieniowaniem UV.

Usuń pożywkę z 10-centymetrowej płytki z komórkami uzdrowiciela. Dodaj sześć mililitrów lodowatego PBS i umieść talerze na lodzie. Jedna płytka wystarcza na trzy eksperymenty.

Zdjąć pokrywę i napromienić komórki. Po osiągnięciu 254 nanometrów z 150 milidżulami na centymetr kwadratowy zbierz komórki, zeskrobując je z płytek za pomocą podnośnika komórkowego, przenieś dwa mililitry zawiesiny komórek do każdej z trzech mikroprobówek, aby granulować komórki. Kręć nimi z maksymalną prędkością przez 10 sekund w czterech stopniach Celsjusza.

Następnie usuń zatrzask supinacyjny, zamroź granulki komórek na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Dodaj 100 mikrolitrów białka, kulki dyny na eksperyment do świeżej mikroprobówki. Jeśli pracujesz z przeciwciałami myszy lub kóz, użyj kulek białka G dyna.

Umyj kulki dwukrotnie buforem do lizy, który można znaleźć w dołączonym pisemnym protokole. Ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu do lizy z dwoma do 10 mikrogramami przeciwciała. Obracaj rurkę w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut.

Następnie umyj kulki trzykrotnie 900 mikrolitrami buforu do lizy i pozostaw je w ostatnim praniu, aż będziesz gotowy do kontynuowania. Do immunoprecypitacji Pałac komórkowy Thora na lodzie. Resus zawieszony w jednym mililitrze buforu do lizy i przenieś go do mikrorurki o pojemności 1,5 mililitra.

Przygotuj rozcieńczenie RNA od jednego do 500. Następnie dodaj 10 mikrolitrów razem z dwoma mikrolitrami turbo DNA do komórki. Lizat. Inkubować próbki dokładnie przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 1 100 obrotów na minutę, natychmiast przenieść do lodu.

Następnie wiruj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 22 000 razy grawitacji przez 20 minut, aby usunąć lizat, ostrożnie zbierz natant SUP, pozostawiając około 50 mikrolitrów lizatu z granulką, aby immunowytrącić kulki. Usuń bufor do mycia, a następnie dodaj przygotowane lizaty komórkowe. Obracaj próbki przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyrzuć środek SUP i umyj kulki dwukrotnie 900 mikrolitrami buforu o wysokiej zawartości soli, który można znaleźć w dołączonym pisemnym protokole. Na koniec umyj koraliki dwukrotnie 900 mikrolitrami buforu do mycia. Następnie przystąp do defosforylacji i dodaj łącznik do trzech pierwszych końców RNA.

Aby oznaczyć RNA, pięć pierwszych końców pracujących za osłoną z pleksiglasu. Usuń supinat z ostatniego przemycia reakcji podwiązania łącznika i ponownie zawieś kulki w ośmiu mikrolitrach gorącej mieszanki PNK. Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Usuń gorącą mieszankę PNK i ponownie użyj. Zawieś koraliki w 20 mikrolitrach jednorazowo nowego bufora ładowania strony. Następnie inkubować próbkę w termomikserze w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Natychmiast umieść próbkę na magnesie, aby wytrącić puste kulki. Załaduj próbki na nową stronę od czterech do 12%. Żel Biss zgodnie z instrukcją producenta.

Załaduj również pięć mikrolitrów wstępnie wybarwionego markera wielkości białka. Uruchom żel na 50 minut przy napięciu 180 woltów. Przenieść kompleksy białkowe RNA z żelu na membranę nitrocelulozową za pomocą aparatu do mokrego transferu NOVA zgodnie z instrukcjami producenta.

Po przeniesieniu przepłukać membranę w buforze PBS. Następnie zawiń go w folię Saran i naświetlaj folią w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wykonuj ekspozycje przez 30 minut, godzinę i noc.

Następnie wyizoluj region błony zgodnie z kompleksami białkowymi RNA od niskich RNA. Eksperymentuj z użyciem automatycznego radiogramu jako maski. Odzyskaj RNA z błony za pomocą trawienia proteinazy K i ekstrakcji chloroformem fenolowym.

Odwrotna transkrypcja RNA za pomocą jednego ze starterów AYP w celu oczyszczenia CDNA w żelu. Wymieszaj sześć mikrolitrów próbki CDNA z sześcioma mikrolitrami dwukrotnego buforu ładującego mocznik TBE. Tuż przed załadowaniem próbek do żelu.

Podgrzewać próbki do 80 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie załaduj próbki na prefabrykowany żel mocznikowy 6% TBE wraz ze znacznikiem o niskiej masie cząsteczkowej. Pozwól żelowi działać przez 40 minut przy napięciu 180 V, zgodnie z opisem producenta, używając górnego barwnika i oznaczeń na plastikowym wsporniku żelu, aby ułatwić wycięcie.

Przetnij trzy prążki po 120 do 200 nukleotydach, 85 do 120 nukleotydów i 70 do 85 nukleotydów. Zauważ, że podkład łukowy i sekwencja L trzy razem odpowiadają za 52 nukleotydy sekwencji klipsa. Dodaj 400 mikrolitrów te i zmiażdż plasterek żelu na małe kawałki.

Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności jednego mililitra inkubować kawałki żelu, wytrząsając z prędkością 1,100 obrotów na minutę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść dwa jednocentymetrowe szklane filtry wstępne w kolumnie spinx CoStar. Przenieś ciekłą część próbki do kolumny, wiruj przez jedną minutę z prędkością 13 000 obrotów na minutę do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj 0,5 mikrolitra błękitu glikologicznego i 40 mikrolitrów octanu sodu o pH 5,5. Następnie wymieszaj próbkę. Dodaj jeden mililitr 100% etanolu.

Wymieszać ponownie i wytrącić próbkę przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Na koniec okrężnie zaokrąglij cząsteczki CD NA, aby przyłączyć region adaptora do pięciu głównych końców. Następnie ponowna linearyzacja i amplifikacja PCR zgodnie z dołączonym pisemnym protokołem przed sekwencjonowaniem biblioteki klipsów do oczu, sukces eksperymentu można monitorować w dwóch etapach.

Autoradiograf kompleksu białkowego RNA po przeniesieniu błony i żelowy obraz produktów PCR na auto radiogramie próbek o niskiej zawartości RNA, radioaktywność rozproszona powinna być widoczna powyżej masy cząsteczkowej białka dla próbek o wysokiej zawartości RNA. Ta promieniotwórczość jest skoncentrowana bliżej masy cząsteczkowej białka. Jeżeli w immunoprecypitacji nie stosuje się przeciwciał, nie powinien być wykrywany żaden sygnał.

Kolejne ważne kontrole swoistości immunoprecypitacji albo emitują promieniowanie UVE, albo wykorzystują komórki, które nie wyrażają interesującego białka. Obraz żelu produktów PCR powinien wykazywać zakres wielkości odpowiadający frakcji CD NA. Należy zauważyć, że startery PCR, P trzy Celexa i P pięć Celexa wprowadzają dodatkowe 76 nukleotydów do wielkości CD NA. Jeśli podczas immunoprecypitacji nie zostanie użyte żadne przeciwciało, nie należy wykryć odpowiadającego mu produktu PCR.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że każdy z 64 kroków jest krytyczny i musi być wykonany ze stuprocentową dokładnością. Dane ICL można zintegrować obliczeniowo z testami funkcjonalnymi obejmującymi całą transkrypcję. W ten sposób można na przykład uzyskać wgląd w regulację przetwarzania RNA zależną od położenia.

W celu analizy danych obliczeniowych chcielibyśmy zapoznać się z naszymi ostatnimi publikacjami we współpracy z Europejskim Instytutem Bioinformatyki Nicholas KA i bla zupan z Uniwersytetu w Liana. A teraz nadszedł czas, abyś rozpoczął własne eksperymenty. Baw się dobrze.