Name: Znakowanie linii komórek danio pręgowanego za pomocą niewykrywalnego laserowo dekstranu fluoresceinowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Naucz się znakowania komórek w zarodkach danio pręgowanego za pomocą dekstranu fluoresceinowego aktywowanego laserem UV. Ta metoda pozwala śledzić losy komórek w biologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Danowi Carlinowi za pomoc w przygotowaniu klatkowej fluoresceiny. Ponadto chcielibyśmy podziękować następującym źródłom finansowania: Vanderbilt University Medical School Program for Developmental Biology Training Grant dla JAC oraz NIH HD054534 dla JTG.

1. Synteza klatkowanej flurosceinowej dekstrany
<ol>
	<li>Odmierz 3,5 - 4 mg aminodextranu i dodaj do dostarczonej przez firmę Invitrogen barwionej probówki zawierającej 1 mg fluoresceiny SE z klatką CMNB. W naszych doświadczeniach stosunek ten pozwala uzyskać średnie obciążenie rzędu ~ 2,5 cząsteczek barwnika na cząsteczkę dextranu.</li>
	<li>Do probówki dodaj 500 μL buforu 0,1 M Na2B4O7 (boranu sodu).</li>
	<li>Zakręć probówkę i mieszaj na wortexie przez 30 sekund, aby rozpuścić aminodextran i fluoresceinę z klatką.</li>
	<li>Pozostaw do reakcji przez noc na mieszalniku wortexowym.</li>
	<li>Odkręć dolną zaślepkę kolumny wirówkowej Zeba i poluzuj korek. Zaznacz kropkę na kolumnie pisakiem z filcu. Umieść kolumnę w stożkowej probówce o pojemności 15 mL.</li>
	<li>Wiruj przy 1000 x g przez 2 min, tak aby kropka była skierowana w stronę centrum rotora. Użyj kolumny natychmiast po zagęszczeniu.</li>
	<li>Umieść zagęszczoną kolumnę w nowej stożkowej probówce 15-mL.</li>
	<li>Złącz mieszaninę reakcyjną i przenieś ją na środek złoża żywicy w zagęszczonej kolumnie. Zakręć korek.</li>
	<li>Wiruj przy 1000 x g przez 2 min, tak aby kropka była skierowana w stronę centrum rotora. Po wirowaniu eluent i górna część kolumny będą miały zbliżony żółty odcień.</li>
	<li>Przenieś żółty eluent (~350 μL) do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Liofilizuj do suchości w SpeedVacu. Przykryj SpeedVac folią.</li>
	<li>Zawiesz otrzymane ~ 2-3 mg bladożółtej piany w wodzie do końcowego stężenia 1% w/v.</li>
	<li>Przechowuj ten roztwór w temperaturze -20 °C w probówkach przykrytych folią. Zaleca się podzielenie roztworu dextranu na alikwoty, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
2. Wstrzykiwanie klatkowanego dekstranu z fluoresceiną do zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Rozcieńczyć roztwór stokowy 1% w/v klatkowanego dekstranu z fluoresceiną w stosunku 1:5 lub 1:10 w 0,2M KCl.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,5 – 1,0 nL roztworu klatkowanej fluoresceiny do żółtka embrionów w stadium jednej komórki, używając wtryskiwacza ciśnieniowego. Po wstrzyknięciu partie embrionów należy przechowywać w ciemności w temperaturze 28,5°C, aby zminimalizować nieswoiste odklatkowanie.</li>
	<li>Ręcznie usunąć choriony z embrionów.</li>
	<li>Zznieczulić embriony w 4% trikainie.</li>
	<li>Embriony zostaną zamontowane w 0,8% agarozie w szalce Petriego o wymiarach 35mmx10mm, a następnie przykryte wodą z jaj.</li>
	<li>Równoważyć roztopioną agarozę w bloku grzewczym o temperaturze 50°C przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety pobrać jeden embrion w minimalnej ilości wody i przenieść go do agarozy. Uwaga: Ważne jest, aby schłodzić probówkę z agarozą w dłoni przez około 30 sekund przed umieszczeniem w niej embrionu, aby uniknąć jego śmierci.</li>
	<li>Pobrać pipetą embrion z probówki wraz z około 50μL agarozy i wycisnąć zawartość na środek szalki Petriego.</li>
	<li>Szybko ustawić embrion za pomocą plastikowej nitki tak, aby komórki przeznaczone do odklatkowania były skierowane do góry. Uwaga: Agaroza szybko stygnie, dlatego należy sprawnie ustawić embrion. Manipulacje po stwardnieniu agarozy mogą uszkodzić embriony.</li>
	<li>Pozostawić agarozę do całkowitego zestalenia (trwa to kilka minut) i wypełnić szalkę w dwóch trzecich wodą z jaj zawierającą 4% trikainy i 0,003% PTU.</li>
</ol>
3. Laserowe uwalnianie flurosceninowego dekstranu
<ol>
	<li>Mikroskop używany do uwalniania z klatek (uncaging) musi być wyposażony w obiektyw imersyjny wodny 40X.</li>
	<li>Stosujemy laser Photonics Instruments z ogniwem barwnikowym 365 nm oraz dichroicznym lustrem dzielącym 70%/30%.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem uwalniania z klatek laser musi zostać ustawiony parfokalnie z obiektywem i osłabiony do odpowiedniej mocy.</li>
	<li>Aby ustawić ostrość lasera, należy umieścić pod obiektywem lustrzane szkiełko przedmiotowe i regulować ostrość obiektywu do momentu, aż rysy na szkiełku staną się widoczne.</li>
	<li>Należy regulować tłumik lasera, aż laser będzie w stanie wywołać wyraźnie widoczną rysę w lustrze za pomocą pojedynczego impulsu.</li>
	<li>Należy regulować ostrość obiektywu w górę i w dół. Jeśli laser wywołuje rysę, gdy obiektyw jest poza zakresem ostrości, należy przekręcić regulację ostrości lasera o ¼ obrotu w górę lub w dół. Czynność tę należy powtarzać do momentu, aż laser będzie w stanie zarysować lustro wyłącznie przy ustawionej ostrości obiektywu.</li>
	<li>Należy umieścić zamontowany embrion pod obiektywem i ustawić ostrość na obszarze, z którego nastąpi uwalnianie.</li>
	<li>Aby przeprowadzić uwalnianie, należy ustawić ostrość na interesującej komórce i naświetlić ją 10–20 impulsami z częstotliwością 2–3 Hz.</li>
	<li>Po uwalnianiu z klatek należy uwolnić embrion, oddzielając agar pęsetą i przenosząc go do wody z jajem zawierającej 0,003% PTU. Embriony powinny rozwijać się w szczelnym pudełku odpornym na światło aż do momentu ich utrwalenia.</li>
</ol>
4. Znakowanie przeciwciałami i detekcja uwolnionej flurosceinowej dekstrany
<ol>
	<li>Utrwal embriony w utrwalaczu Ab (4% paraformaldehyd, 0,3 mM CaCl2)2, 8% sacharozy, 1X roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, pH 7,3) przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc (O/N) w 4°CPrzez cały czas trwania etapów znakowania przechowywać embriony w szczelnym przed dostępem światła pudełku lub w probówce owiniętej folią aluminiową.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i zastąpić go 100% MeOH, pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej, usunąć MeOH i zastąpić go świeżym 100% MeOH.</li>
	<li>Przechowywać w MeOH w temperaturze -20°C przez co najmniej 30 minut. Uwaga: Próbki można przechowywać w MeOH przez maksymalnie dwa tygodnie, zanim rozpocznie się degradacja epitopów.</li>
	<li>Rehydratyzuj zarodki, wykonując 5-minutowe przemycia w temperaturze pokojowej w kolejno: 75% MeOH/1X soli fosforanowej buforowanej z 0,1% Tween 20 (1X PBSTw), 50% MeOH/50% 1X PBSTw oraz 25% MeOH/75% 1X PBSTw.</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie przez 5 minut w 1XPBSTw.</li>
	<li>Jeśli embriony są &gt;24-godzinne zarodki poddać permeabilizacji za pomocą 10 μg/mL proteinaza K w 1XPBSTw. Czas permeabilizacji zależy od etapu rozwoju. Pięć minut w proteinazie K jest wystarczające, jeśli zarodki znajdują się między 24. a 48. godziną po zapłodnieniu (hpf). W przypadku starszych larw może być wymagany dłuższy czas. Ponownie utrwalić w utrwalaczu Ab przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przemyć pięciokrotnie przez 5 minut w 1XPBSTw w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować w roztworze blokującym (1XPBS, 0,1% Triton x100, 10% surowicy owczej, 10% albuminy surowicy bydlęcej, 1% dimetylosulfoksydu) przez 1–2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwotne (anty-fluoresceinę oraz przeciwciała przeciwko markerom specyficznym dla danego typu komórek) w roztworze blokującym.</li>
	<li>Inkubować zarodki przez noc w temperaturze 4°C w roztworze zawierającym przeciwciała pierwszorzędowe.</li>
	<li>Przemyć cztery razy po 20 minut w 1X roztworze buforu fosforanowego (PBS) z dodatkiem 0,1% Triton x100 (PBSTx) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała wtórne znakowane fluorescencyjnie (zazwyczaj w stosunku 1:300) w roztworze blokującym.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 4°C w roztworze zawierającym przeciwciała wtórne.</li>
	<li>Przemyć czterokrotnie przez 20 minut w 1XPBSTx w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przezroczyć zarodki w 50% glicerolu/50% 1XPBS przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej, następnie usunąć mieszaninę glicerolu/PBS, dodać 100% glicerolu i pozostawić przez noc w 4°C.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Po immunoznakowaniu w komórkach poddanych procesowi uncagingu (uwolnienia z klatki) powinien widnieć obszar o zwiększonym natężeniu barwienia (Rysunek 1). Często obserwuje się stosunkowo wysoki stosunek sygnału do szumu w &gt;48-godzinne zarodki zebrafish, ze względu na spontaniczne uwalnianie fluoresceiny.
<img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="markery foxd3:GFP i fluoresceiny, widok grzbietowy w mikroskopii fluorescencyjnej; analiza ekspresji genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Markowanie linii komórkowych kompleksu szyszynkowego danio pręgowanego. W 24 hpf część przedniego zrębka szyszynkowego, wyznaczona przez ekspresję foxd3:GFP, została uwolniona z klatek za pomocą impulsów laserowych UV. A) Do 48 hpf z obszaru uwolnienia (białe koło) wyłoniła się lewostronna grupa komórek nazywana ciałem parapinealnym (czerwone koło). B) Sygnał z uwolnionej fluoresceiny jest wzmocniony w ciele parapinealnym (czerwone koło) oraz w narządzie szyszynkowym (białe koło).

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+Fluorescent+Probes+and+Research+Chemicals%22">Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals</a>. , 9th Edition, 707-711 (2002).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Jak opisano, niniejszy protokół zapewnia stosunkowo szybką metodę znakowania linii komórkowych u danio pręgowanego, opartą na powszechnie stosowanych technikach mikroiniekcji, mikroskopii i immunofluorescencji. Ustaliliśmy, że odblokowywanie laserowe jest najwydajniejszym i najbardziej opłacalnym sposobem lokalnego odblokowywania fluoresceiny. Metoda ta może być wykorzystana do znakowania linii z punktami końcowymi eksperymentu do 4 dpf. Jednak w miarę podziałów komórek stężenie odblokowanej fluoresceiny w pojedynczej ko...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-caged fluorescein SE</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodekstran, 10kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba desalt spin columns</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało przeciw fluoresceinie</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 osiołcze przeciwciało przeciw kozie</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 35mmx10mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop złożony z obiektywem imersyjnym wodnym 40x</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny system iluminacji laserowej MicroPoint</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>Nitka plastikowa</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło wiroksyjne</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Iniektor ciśnieniowy</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie linii komórkowych ryb danio-pręgowanych za pomocą dekstranu fluoresceiny uwalnianego laserowo

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Centralnym problemem biologii rozwoju jest wywnioskowanie pochodzenia niezliczonych typów komórek występujących u kręgowców, które powstają z niezróżnicowanych prekursorów. Badacze stosowali różne metody znakowania linii komórkowych, takie jak znakowanie DiI1 oraz wstrzykiwanie pod ciśnieniem enzymów śledzących2, aby ustalić los komórek w późniejszych etapach rozwoju w systemach modelowych. Pierwsze mapy losu w rybach danio (Danio rerio) sporządzono poprzez jontoforezę barwników fluorescencyjnych, takich jak dekstran rodamanowy, do pojedynczych komórek w odrębnych obszarach zarodka i śledzenie losu znakowanej komórki w czasie3-5. Choć skuteczne, metody te są wymagające technicznie i wymagają specjalistycznego sprzętu, który nie jest powszechnie dostępny w laboratoriach zajmujących się rybami danio. Ostatnio w badaniach nad rybami danio coraz częściej wykorzystuje się fotokonwertowalne białka fluorescencyjne, takie jak Eos i Kaede, które pod wpływem światła ultrafioletowego nieodwracalnie zmieniają fluorescencję z zielonej na czerwoną6-8. Przejrzystość optyczna zarodka ryby danio oraz względna łatwość transgenezy sprawiły, że stały się one szczególnie atrakcyjnymi narzędziami do znakowania linii komórkowych i obserwacji migracji komórek in vivo7. Mimo swojej użyteczności białka te mają pewne wady w porównaniu z metodami znakowania linii komórkowych za pomocą barwników. Najistotniejszą z nich jest trudność, jaką napotkaliśmy w uzyskaniu wysokiej rozdzielczości 3-D podczas fotokonwersji tych białek. W tym świetle prawdopodobnie najlepsze połączenie rozdzielczości i łatwości zastosowania w znakowaniu linii komórkowych u ryb danio oferuje klatkowany dekstran fluoresceiny — barwnik fluorescencyjny związany z grupą gaszącą, która maskuje jego fluorescencję9. Barwnik ten może zostać następnie „uwolniony z klatki” (odłączony od grupy gaszącej) w konkretnej komórce przy użyciu światła UV z lasera lub lampy rtęciowej, co umożliwia wizualizację jego fluorescencji lub detekcję immunologiczną. W przeciwieństwie do metod jontoforetycznych, klatkowaną fluoresceinę można wstrzykiwać za pomocą standardowych aparatów do iniekcji i uwalniać z klatki przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w otwór regulowany (pinhole)10. Ponadto przeciwciała przeciwko fluoresceinie wykrywają tylko formę uwolnioną z klatki, a epitop dobrze znosi utrwalanie11. Wreszcie, klatkowana fluoresceina może być aktywowana z bardzo wysoką rozdzielczością 3-D, zwłaszcza przy zastosowaniu mikroskopii dwufotonowej12,13. Niniejszy protokół opisuje metodę znakowania linii komórkowych za pomocą klatkowanej fluoresceiny i laserowego uwalniania z klatki. Następnie uwolniona fluoresceina jest wykrywana jednocześnie z innymi epitopami, takimi jak GFP, poprzez znakowanie przeciwciałami.

Niniejszy protokół opisuje metodę znakowania i śledzenia losów niewielkich grup komórek w embrionach ryb danio pręgowany poprzez UV-odblokowanie uwięzionej fluoresceiny, a następnie immunoznakowanie całego preparatu w celu wzmocnienia sygnału z odblokowanej fluoresceiny.

Znakowanie linii komórkowych ryb danio-pręgowanych za pomocą dekstranu fluoresceiny uwalnianego laserowo

Centralnym problemem biologii rozwoju jest ustalenie pochodzenia niezliczonych typów komórek występujących u kręgowców, które powstają z niezróżnicowanych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest znakowanie linii komórkowych w embrionie danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez syntezę klatkowanej fluoresceiny, a następnie wstrzyknięcie jej do embrionów danio pręgowanego. Następnie embriony są montowane w agarozie, aby komórki przeznaczone do znakowania były dostępne.Następnie używa się lasera UV do aktywacji uwięzionej fluoresceiny w wybranych komórkach zarodka. Na koniec zarodki są pobierane po osiągnięciu pożądanego stadium rozwoju, a znakowane komórki są wykrywane w odniesieniu do markerów konkretnych linii komórkowych. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące losy wybranych komórek w zarodkach dzięki fotoutzwolnieniu oraz mikroskopii immunofluorescencyjnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak fotokonwersja klatki, jest to, że wielokolorowa immunofluorescencja pozwala na wykrycie uwolnionej fluoresceiny oprócz innych przeciwciał specyficznych dla wiązań komórkowych. Aby wstrzyknąć dekstran z klatkowaną fluoresceiną do embrionów ryb zebrafish, należy go najpierw zsyntetyzować i przygotować roztwór stężeniem 1% w/v. Alikwoty zapasu należy przygotować zgodnie z towarzyszącym protokołem pisemnym.Następnie przygotuj alikwot rozcieńczalnika w stosunku od 1:5 do 1:10 w 0,2 M chlorku potasu. Dalej, wstrzyknij od 0,5 do 1 nL roztworu uwięzionej fluoresceiny do żółtka embrionów w stadium jednej komórki. Po wykonaniu wtrysku za pomocą injektora ciśnieniowego, partie embrionów należy przechowywać w ciemności w temperaturze 28,5 °C, aby ograniczyć nieswoiste uwalnianie fluoresceiny do pożądanego etapu rozwoju.Ręcznie usuń chorion z embrionów, a następnie znieczul embriony w 4% tricainum. Aby przygotować embriony do montażu, inkubuj 0,8% roztopionego agarosu w bloku grzewczym o temperaturze 50 °C przez co najmniej 15 minut. Następnie schładzaj probówkę w dłoni przez około 30 sekund. Przed dodaniem embrionów, za pomocą szklanej pipety, pobierz jeden embrion w minimalnej ilości wody i przenieś go do agarosu. Pobierz z probówki embrion wraz z około 50 µL agarosu i przenieś zawartość na środek szalki Petriego o wymiarach 35 mm na 10 mm.Używając plastikowej nici, szybko zorientuj embrion tak, aby komórki przeznaczone do odblokowania (uncaging) były skierowane ku górze. Pozwól agarowi całkowicie zastygnąć i wypełnić szalkę. Wypełnij szalkę w dwóch trzecich wodą z jajem zawierającą 4% trica i 0,003% PTU; przechowuj embriony w pudełku chroniącym przed światłem do momentu odblokowania.Aby przeprowadzić fotouwalnianie (laser uncaging) dekstranu fluoresceiny, należy użyć mikroskopu złożonego z obiektywem imersyjnym wodnym 40 x. Przed uwalnianiem stosujemy laser firmy Photonics Instruments z ogniwem barwnikowym 365 nm oraz dichroicznym lustrem dzielącym 70%30%. Laser musi zostać ustawiony współogniskowo z obiektywem i osłabiony do odpowiedniej mocy w celu skupienia wiązki.Umieść lustrzaną szkiełko pod obiektywem i ustaw ostrość obiektywu, aż rysy na szkiełku staną się widoczne. Reguluj tłumik lasera, dopóki laser nie wytworzy wyraźnie widocznego rysy w lustrze za pomocą pojedynczego impulsu, korygując ostrość obiektywu w górę i w dół. Jeśli laser jest w stanie wytworzyć rysę przy braku ostrości obiektywu, skoryguj ostrość lasera o jedną ćwiartkę.Zwiększ lub zmniejsz moc. Powtarzaj czynność, aż laser będzie w stanie zarysować lustro. Dopiero gdy obiektyw zostanie ustawiony w ognisku, umieść zamontowany embrion pod obiektywem i ustaw ostrość na obszarze, który ma zostać uwolniony, aby przeprowadzić proces uwalniania.Skupić się na wybranej komórce i poddać ją impulsom 10–20 razy z częstotliwością od dwóch do trzech herców. Po uwolnieniu z klatek (uncaging), wyzwolić zarodek, usuwając pęsetą chorion i przenosząc go do wody dla jaj zawierającej 0,003% PTU. Utrwalić zarodki w utrwalaczu do przeciwciał przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.Usunąć utrwalacz i zastąpić go 100%metanolem. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć metanol i zastąpić go świeżym 100%metanolem.Przechowywać embriony w metanolu w temperaturze -20°C przez co najmniej 30 minut. Można je przechowywać w metanolu do dwóch tygodni, zanim dojdzie do degradacji epitopów. Rehydratować embriony, wykonując pięciominutowe płukania w temperaturze pokojowej w kolejno: 75% metanolu i 25% 1x PBS z 0,1% tween 20, 50% metanolu i 50% 1x PBS z tween 20, a następnie w 25% metanolu i 75% 1x PBS z tween 20, i na koniec trzykrotnie przez pięć minut w 1x PBS z tween 20.Jeśli zarodki mają więcej niż 24 godziny, poddaj je permeabilizacji z użyciem 10 µg/mL Proteinazy K w roztworze XPBS tween 20. Czas permeabilizacji zależy od stadium rozwoju zarodka. Pięć minut w Proteinazie K jest wystarczające.Jeśli zarodki znajdują się w przedziale od 24 do 48 godzin po zapłodnieniu, dla starszych larw może być wymagany dłuższy czas. Ponownie zastosuj utrwalacz przeciwciał przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj zarodki pięciokrotnie po pięć minut w 1% XPBS tween 20 w temperaturze pokojowej.Następnie inkubować w roztworze blokującym od jednej do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczyć w roztworze blokującym. Następnie inkubować embriony przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w roztworze zawierającym przeciwciała pierwszorzędowe, a następnego ranka przemyć embriony cztery razy w 1x PBS Triton X 100 i rozcieńczyć fluorescencyjnie znakowane przeciwciała drugorzędowe w roztworze blokującym.Inkubować embriony przez noc w temperaturze 4 °C w roztworze zawierającym przeciwciała wtórne. Po czterokrotnym przemyciu w 1x PBS z Tritonem X-100, przeprowadzić przejrzystanie embrionów w 50% glicerolu i 1x PBS przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć mieszaninę glicerolu i PBS, dodać 100% glicerolu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.Wyniki reprezentatywne dla larw kontrolnych i larw poddanych fotouwalnianiu przedstawiono w formie projekcji konfokalnych. Zarodki kontrolne zostały wstrzyknięte z klatkowaną fluoresceiną, ale nie poddano ich fotouwalnianiu w 48 godzinach po zapłodnieniu. Zarodek kontrolny wykazuje znakowanie GFP w kompleksie szyszynkowym.Występuje pewne punktowe znakowanie tła, lecz nie stwierdza się zlokalizowanej akumulacji znakowanej fluoresceiny. Zarodki poddane fotouwalnianiu wykazują wyraźną akumulację uwolnionej fluoresceiny w niektórych komórkach znakowanych GFP. Są to potomki komórek, w których dokonano fotouwalniania z klatki 24 godziny wcześniej, z niewielkimi modyfikacjami.Niniejszą procedurę można wykorzystać do znakowania linii komórkowych niemal każdej tkanki w embrionie danio pręgowanego przed upływem 48 godzin od zapłodnienia.

lineage-labeling-zebrafish-cells-with-laser-uncagable-fluorescein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie linii komórek rybki zebra z nieaktywowanym fluoresceinowym dekstranem laserowym

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Konstrukcje typu Function-Spacer-Lipid (FSL) pozwalają na modyfikację charakterystyki powierzchni żywych komórek i wirionów bez utraty ich żywotności. Metoda ta wymaga jedynie prostego kontaktu roztworu konstrukcji FSL z komórką lub wirionem, co prowadzi do spontanicznej i stabilnej inkorporacji w powierzchnię.

Konstrukcje FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Ukierunkowane manipulacje mające na celu wywołanie ukierunkowanego stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach były stosunkowo trudne do osiągnięcia. W tym artykule opisano metodę ablacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, polegającą na selektywnym stresowaniu i zabijaniu pojedynczych komórek w hodowli komórkowej i żywych zwierzętach, w oparciu o standardowy konfokalny laser UV.

Wyzwalanie stresu i śmierci komórek za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej z laserem UV

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Naucz się znakowania komórek w zarodkach danio pręgowanego za pomocą dekstranu fluoresceinowego aktywowanego laserem UV. Ta metoda pozwala śledzić losy komórek w biologii rozwojowej.

Znakowanie linii komórkowych ryb danio-pręgowanych za pomocą dekstranu fluoresceiny uwalnianego laserowo

Przeglądaj więcej filmów