Name: Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Poznaj metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci fibrynowo-alginianowej. Technika ta wspiera dojrzewanie oocytów zachowując interakcje międzykomórkowe w hodowli in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez NIH (U54HD41857 oraz PL1EB008542, grant P30 Biomaterials Core w ramach Oncofertility Consortium Roadmap).

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
<li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li>
<li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li>
<li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture%2C+in+vitro+follicle+development+and+transplantation%3A+implications+for+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li>
<li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li>
<li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li>
<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+micro+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona metoda enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w FA-IPN umożliwia hodowlę pęcherzyków w środowisku trójwymiarowym in vitro. FA-IPN to dynamiczna, komórkowo responsywna macierz, w której początkowe właściwości mechaniczne są określone przez kombinację fibryny i alginianu. Podczas hodowli enkapsulowany pęcherzyk aktywuje proteazy, które degradują tylko jeden składnik IPN – fibrynę – co prowadzi do stopniowego zmniejszania sztywności żelu, która pod koniec hodowli wynika wyłącznie z pozostałego alginianu...

<table><tbody><tr><td>Fetuina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>Roche Group</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>rFSH</td><td>National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw fibryny Tisseel</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>Alginian sodu</td><td>FMC BioPolymers</td><td>LF200DL</td><td>Mw 418kDa</td></tr></tbody></table>

metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Miesiączkowy pęcherzyk jajnika jest jednostką funkcjonalną jajnika, która wydziela hormony płciowe i wspiera dojrzewanie oocytu. Techniki hodowli pęcherzyków in vitro stanowią narzędzie do modelowania rozwoju pęcherzyka w celu badania biologii podstawowej, a ponadto są rozwijane jako metoda zachowania płodności w praktyce klinicznej1-4. Nasz system hodowli in vitro wykorzystuje hydrożele w celu naśladowania naturalnego środowiska jajnika poprzez utrzymanie trójwymiarowej architektury pęcherzyka, interakcji międzykomórkowych oraz sygnalizacji paracrynnej kierującej rozwojem pęcherzyka 5. Wcześniej pęcherzyki z sukcesem hodowano w alginianie, obojętnym polisacharydzie pochodzenia glonowego, który żeluje w obecności jonów wapnia6-8. Hydrożele alginianowe tworzone w stężeniu 0,25% w/v okazały się najbardziej sprzyjające hodowli pęcherzyków i pozwoliły na zachowanie najwyższej zdolności rozwojowej 9. Hydrożele alginianowe nie są degradowalne, w związku z czym wzrost średnicy pęcherzyka powoduje powstanie siły ściskającej, która może wpływać na jego wzrost10. Następnie opracowaliśmy system hodowli oparty na przenikającej się sieci fibrynowo-alginianowej (FA-IPN), w której mieszanina fibryny i alginianu żeluje się jednocześnie. Kombinacja ta zapewnia dynamiczne środowisko mechaniczne, ponieważ początkowo oba komponenty przyczyniają się do sztywności macierzy; jednak proteazy wydzielane przez rosnący pęcherzyk degradują fibrynę w macierzy, pozostawiając jedynie alginian jako wsparcie. W przypadku sieci IPN zawartość alginianu może zostać zredukowana poniżej 0,25%, co nie jest możliwe przy zastosowaniu samego alginianu 5. Dzięki temu, w miarę rozrastania się pęcherzyka, będzie on poddawany mniejszej sile ściskającej ze względu na zredukowaną zawartość substancji stałych. W niniejszej pracy opisujemy metodę enkapsulacji oraz system hodowli in vitro pęcherzyków jajnika w sieci FA-IPN. Dynamiczne środowisko mechaniczne naśladuje naturalne środowisko jajnika, w którym małe pęcherzyki znajdują się w sztywnej korze i przemieszczają się do bardziej podatnego rdzenia w miarę zwiększania swoich rozmiarów11. Komponent degradowalny może mieć krytyczne znaczenie dla wdrożenia klinicznego, aby umożliwić ponad 106-krotny wzrost objętości, jakiego ludzkie pęcherzyki zazwyczaj ulegają in vivo.

Opisano nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci interpenetrującej z fibryny i alginianu. System ten łączy wsparcie strukturalne z degradacją proteolityczną, aby wspierać rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu wytworzenia dojrzałych oocytów. Metoda ta może być stosowana do hodowli agregatów komórkowych w celu utrzymania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Pęcherzyk jajnikowy jest jednostką funkcjonalną jajnika, która wydziela hormony płciowe i wspiera dojrzewanie oocytu. Techniki hodowli pęcherzyków in vitro umożliwiają...

Niniejszy protokół opisuje nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w interpenetrującej sieci fibryno-alginowej do hodowli in vitro. Pęcherzyk wtórny składa się z centralnie położonego oocyta otoczonego kilkoma warstwami komórek somatycznych, które wspierają rozwój oocyta; enkapsulacja pęcherzyka i jego hodowla w środowisku trójwymiarowym umożliwiają wzrost pęcherzyka, wspierając jednocześnie komunikację między wieloma przedziałami komórkowymi i utrzymując sferyczną strukturę pęcherzyka. W pierwszym kroku niniejszego protokołu należy wyizolować pęcherzyki wtórne z jajników myszy w 16. dniu życia, stosując metodę kropelkową.Przepłucz i przenieś pęcherzyki do roztworu enkapsulacyjnego. Odessaj każdy pęcherzyk za pomocą pipety z roztworem alginianu fibrynogenu do roztworu trombiny z wapniem, a następnie pozwól kuleczkom sieciować w przypadku metody paraformy. Przenieś poszczególne pęcherzyki do kropel roztworu alginianu fibrynogenu na szklanym slajdzie powleczonym paraformą i dodaj roztwór trombiny, aby zainicjować sieciowanie F-A-I-P-N.Następnie przenieś enkapsulowane pęcherzyki do pożywki wzrostowej i wykonaj obrazowanie enkapsulowanego pęcherzyka w FA IPN. Ponieważ system ten łączy wsparcie strukturalne z biologiczną reaktywnością, aby wspomagać wzrost i rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu produkcji komórek jajowych, może on być stosowany do hodowli agregatów komórkowych w celu zachowania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji. Witam, nazywam się Lonnie Shea i dzięki współpracy z Three Wood Drip opracowaliśmy system hodowli do dojrzewania pęcherzyków jajnikowych in vitro.Niniejsze badanie hodowlane odzwierciedla rzeczywistą współpracę między bioinżynierią a biologią rozrodu. Dziś osoby, które opracowały ten system hodowli, przedstawią Państwu zastosowane metody. Pierwszą z nich jest Ariel Checkoff, pracownik postdoktorski w dziedzinie bioinżynierii, który opracował system biomateriałowy.Następnie przedstawiam Minsu, biologa reprodukcji z Katedry Położnictwa i Ginekologii, który opracował procedury postępowania z tkanką jajnika. Wspólnie zaprezentują Państwu metody faktycznego kapsułkowania i hodowli tkanki jajnika. Główną zaletą opisanej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowa hodowla na płaskiej powierzchni plastikowej, jest to, że system fibryno-alginianowy wspiera trójwymiarową architekturę pęcherzyka, zapewniając jednocześnie mechanicznie dynamiczne środowisko dla szybko rozrastającego się pęcherzyka.Dynamiczne mechaniczne mikrośrodowisko w obecnym układzie zapewnia dodatkowe korzyści podczas przenoszenia tej technologii z modelu mysiego do potencjalnych zastosowań klinicznych, ponieważ ludzkie pęcherzyki wymagają znacznie bardziej rozbudowanego wzrostu w celu uzyskania dojrzałych i zdolnych do zapłodnienia oocytów. Dla uzyskania optymalnych wyników wszystkie preparaty należy wykonywać w pożywkach opartych na L 15 w celu kontroli pH, na podgrzewanych stolikach w temperaturze 37 °C dla kontroli temperatury oraz w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zminimalizować kontaminację bakteryjną. Świeżo wyizolowane jajniki należy przenieść do nowej szalki Petriego o średnicy 35 mm z 1–2 mL pożywki podtrzymującej zawierającej 0,1% kolagenazy i 0,1% DNazy, a następnie inkubować przez 15 minut w inkubatorze CO2.Przemyć próbki w DM, aby usunąć kolagenazę, a następnie przenieść je do 35 milimetrowej szalki Petriego z nowym DM w celu wyizolowania pęcherzyków z jajnika. Delikatnie oddzielić pęcherzyki od całego jajnika, używając igieł o rozmiarze 28 G lub 30 G przymocowanych do strzykawek insulinowych. Usunąć jak najwięcej komórek zrębu, nie naruszając integralności pęcherzyka.Wypreparuj z każdego jajnika od 20 do 40 pęcherzyków wtórnych o średnicy od 130 do 150 µm. Pęcherzyki te posiadają zazwyczaj od dwóch do trzech warstw komórek ziarnistych. Następnie do naczynia do IVF wlej jeden mililitr mm do centralnej studzienki oraz trzy mililitry mm do zewnętrznego pierścienia.Przenieś nienaruszone pęcherzyki za pomocą pipety do zewnętrznego pierścienia naczynia do IVF. Przechowuj to naczynie do IVF w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla. Po zebraniu wszystkich pęcherzyków.Próbki należy zbadać pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu od pięciu do ośmiu krotności; należy wybrać pęcherzyki o rozmiarze od 130 do 150 micron, które wykazują prawidłową morfologię, w tym dwie do trzech warstw komórek ziarnistych, brak separacji między oocytem a komórkami ziarnistymi oraz nienaruszone, okrągłe oocyty. Zdrowe pęcherzyki należy przenieść do środka innej szalki IVF w celu enkapsulacji. W przypadku zastosowania metody kropelkowej enkapsulacji pęcherzyków, do środkowego otworu szalki IVF należy dodać 1 ml roztworu trombiny o stężeniu 50 international units per milliliter; roztwór zapasowyy fibrynogenu należy rozmrozić i przechowywać w lodzie.Przed enkapsulacją należy doprowadzić fibrynogen do temperatury pokojowej. Bezpośrednio przed użyciem przygotuj roztwór alginianu fibrynogenu, mieszając 1x PBS z 0,5% alginianem oraz 50 mg/ml fibrynogenu.Fibrynogen w stosunku dwa do jednego w 1,7 mililitrowej sterylnej probówce do mikrocentrifugowania. Delikatnie wymieszać na wortexie i odwirować lekko mętną roztwór, aby zmniejszyć parowanie. Wyłączyć podgrzewacz stolika mikroskopu operacyjnego w narożniku zewnętrznego pierścieniayy czarki do IVF.90 µL roztworu alginianu fibrynogenu do enkapsulacji oraz druga kropla o objętości 10 µL do etapu płukania. Przenieś od 10 do 15 mieszyków do kropli 10 µL z minimalną ilością pożywki hodowlanej, szybko wymieszaj je z minimalną ilością roztworu, przenieś wszystkie mieszyki do kropli 90 µL i wymieszaj. Odessij jeden mieszyk wraz z 5 µL roztworu alginianu fibrynogenu za pomocą końcówki 10 µL, a następnie wprowadź roztwór alginianu fibrynogenu wraz z mieszykiem do roztworu trombiny znajdującego się na środku naczynia do IVF. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie mieszyki zostaną zamknięte w kapsułkach.Pozostawić koraliki na pięć do siedmiu minut, aby doprowadzić do sieciowania żelu w roztworze trombiny i wapnia. Koraliki ściemnieją w miarę tworzenia się fibryny. Przenieść koraliki do pożywki utrzymującej, zaczynając od tych o ciemniejszym kolorze.W pierwszej kolejności inkubować przez 15 do 30 minut w temperaturze 37 °C i wypłukać pozostałą trombinę. Następnie przenieść kuleczki do płytki hodowlanej i wykonać obrazowanie. Bezzwłocznie przygotować roztwór alginianu i fibrynogenu, mieszając 0,5% alginianu oraz 50 mg/mL.Fibrinogen w stosunku jeden do jednego w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml. Nanieść pipetą 7,5 µl kropli mieszaniny fibrynogenu i alginianu na szkiełko pokryte parfuminą. Przesunąć z dystanserem o szerokości 3 mm i przenieść jeden mieszyczek do każdej kropli, używając minimalnej ilości pożywki.Do każdej kropli dodaj 7,5 µl roztworu trombiny, nie dotykając i nie mieszając kropli z mieszką, ponieważ żel tworzy się niemal natychmiastowo. Przykryj żele drugą szybką pokrytą Parafilmem. Przesuń i umieść w szalce o średnicy 100 mm dnem do góry w inkubatorze na pięć minut.Przenieś lepkie koraliki do pożywki utrzymującej, używając w razie potrzeby pęsety, a następnie co dwa dni do dołka hodowlanego. Obrazuj hodowane pęcherzyki za pomocą mikroskopu świetlnego i mierz średnicę pęcherzyków w programie Image J. Co dwa dni wymieniaj również połowę pożywki wzrostowej na świeżą zrównoważoną pożywkę wzrostową. Po ośmiu dniach hodowli hydrożel powinien stać się przejrzysty z powodu całkowitej degradacji składników fibryny, a pęcherzyki mogą osiągnąć swoje końcowe wymiary przekraczające 400 micronów średnicy. Usuń pożywkę wzrostową i dodaj 100 microliters 10 international units per milliliter.Dodaj alginianoliazę do pożywki alpha-MEM, aby zdegradować alginian. Umieść płytkę w inkubatorze na 25 do 30 minut. Następnie wyjmij pęcherzyki z częściowo rozpuszczonych kulek za pomocą końcówki z tępym zakończeniem.Przenieś pęcherzyki do zewnętrznego pierścienia naczynia do IVF z medium do mikrodysekcji, aby wypłukać alginian, a następnie przenieś je do pierścienia wewnętrznego. Następnie przenieś pęcherzyki antralne do zewnętrznego, a potem do wewnętrznego pierścienia naczynia do IVF z medium do dojrzewania zawierającym HCG i EGF; inkubuj w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przez 15 do 16 godzin. Sprawdź hodowle pod kątem ekspansji komórek cumulus, aby usunąć komórki cumulus.Dodaj roztwór IDE o wyższym stężeniu do uzyskania stężenia końcowego 0,1 mg/mL i inkubuj przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Odessij pipetą ustną komórki obrąbka z oocytów, a następnie określ ich stopień dojrzałości pod mikroskopem.Alginian jest naturalnym biomateriałem odpowiednim do hodowli pęcherzyków in vitro ze względu na łagodne właściwości i charakterystykę biochemiczną, taką jak wielkość oczek sieci, kontrolowana sztywność oraz obojętność biologiczna. Małe pęcherzyki zamknięte w kapsułkach wywierają niewielką siłę nacisku w alginianie na początku hodowli. Jednak w miarę rozrostu pęcherzyka zwiększa się objętość wypierana w kuleczce, co skutkuje większą siłą nacisku w kierunku przeciwnym do ekspansji pęcherzyka.Łańcuchy poszczególnych polimerów są całkowicie splątane w roztworze alginianu i fibryliny przed sieciowaniem. Oba składniki F-A-I-P-N zaczynają sieciować natychmiast po wystawieniu na mieszaninę trombiny i wapnia; pęcherzyki degradują komponent fibryny F-A-I-P-N podczas okresu hodowli, co objawia się wyraźnym okręgiem wokół pęcherzyka. Architektura 3D pęcherzyka jest podtrzymywana przez pozostały alginian.Obrazy te przedstawiają wzrost pęcherzyków wtórnych w F-A-I-P-N w czasie od 0, 4, 6 i 8 dnia oraz wynikający z tego etap M dwa X. Z ciałkiem polarnym, aprotynina jest inhibitorem proteazy, który można dodać do pożywki hodowlanej w celu spowolnienia degradacji fibryny. Gdy do pożywki hodowlanej w ciągu pierwszych czterech dni doda się 0,01 TIU aprotyniny na mililitr, pęcherzyki nie są w stanie degradować macierzy. Po usunięciu aprotyniny pęcherzyki wznawiają wzrost i osiągają stadium antralne.Jednakże w przypadku mieszków hodowanych początkowo w wyższym stężeniu aprotininy, wzrost był zahamowany. Przedstawiliśmy nową technikę różnicowania enkapsulacji mieszków oraz hodowli in vitro w trójwymiarowej sieci fibrynowo-alginatowej. System ten nie tylko utrzymuje nienaruszoną strukturę mieszków podczas hodowli, ale także wspiera pomyślną folikulogenezę in vitro, co prowadzi do powstania struktur w stadium M2.Ta technologia jest istotna dla zrozumienia mechanizmów działania pęcherzyka jajnikowego i ma potencjał, aby zapewnić opcje zachowania płodności młodym pacjentkom z chorobami nowotworowymi w szerszym ujęciu. Ten system hodowli może być wykorzystany do hodowli skupisk komórek lub hodowli komórek w trakcie ich organizowania się w struktury. Te systemy hodowli 3D stanowią cenne narzędzia do molekularnej analizy wzrostu tkanek.

a-method-for-ovarian-follicle-encapsulation-culture-proteolytically

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metoda enkapsulacji i hodowli mieszków jajnikowych w proteolitycznie rozkładalnym 3-wymiarowym układzie

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Ten film opisuje protokoły hermetyzacji kompleksów wzgórko-oocytów świń (COC) w kulkach fibrynowo-alginianowych w celu stworzenia hodowli 3D. Ten system dojrzewania in vitro utrzymuje normalną komunikację między komórkami, zapewniając dojrzewanie oocytów i zachowując ich żywotność.

Hodowla 3D COC świń: procedura kapsułkowania kompleksów oocytów cumulusa w kulkach hydrożelowych z polimeru fibrynowo-alginianowego

W tym filmie opisujemy protokół enkapsulacji oocytów świń w hydrofobowych mikrobioreaktorach.

System mikrobioreaktora z płynnego marmuru: protokół hodowli 3D do enkapsulacji oocytów świń

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Poznaj metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci fibrynowo-alginianowej. Technika ta wspiera dojrzewanie oocytów zachowując interakcje międzykomórkowe w hodowli in vitro.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Przeglądaj więcej filmów