Name: Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Poznaj metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci fibrynowo-alginianowej. Technika ta wspiera dojrzewanie oocytów zachowując interakcje międzykomórkowe w hodowli in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez NIH (U54HD41857 oraz PL1EB008542, grant P30 Biomaterials Core w ramach Oncofertility Consortium Roadmap).

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
<li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li>
<li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li>
<li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture%2C+in+vitro+follicle+development+and+transplantation%3A+implications+for+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li>
<li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li>
<li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li>
<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+micro+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona metoda enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w FA-IPN umożliwia hodowlę pęcherzyków w środowisku trójwymiarowym in vitro. FA-IPN to dynamiczna, komórkowo responsywna macierz, w której początkowe właściwości mechaniczne są określone przez kombinację fibryny i alginianu. Podczas hodowli enkapsulowany pęcherzyk aktywuje proteazy, które degradują tylko jeden składnik IPN – fibrynę – co prowadzi do stopniowego zmniejszania sztywności żelu, która pod koniec hodowli wynika wyłącznie z pozostałego alginianu...

<table><tbody><tr><td>Fetuina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>Roche Group</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>rFSH</td><td>National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw fibryny Tisseel</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>Alginian sodu</td><td>FMC BioPolymers</td><td>LF200DL</td><td>Mw 418kDa</td></tr></tbody></table>

metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Miesiączkowy pęcherzyk jajnika jest jednostką funkcjonalną jajnika, która wydziela hormony płciowe i wspiera dojrzewanie oocytu. Techniki hodowli pęcherzyków in vitro stanowią narzędzie do modelowania rozwoju pęcherzyka w celu badania biologii podstawowej, a ponadto są rozwijane jako metoda zachowania płodności w praktyce klinicznej1-4. Nasz system hodowli in vitro wykorzystuje hydrożele w celu naśladowania naturalnego środowiska jajnika poprzez utrzymanie trójwymiarowej architektury pęcherzyka, interakcji międzykomórkowych oraz sygnalizacji paracrynnej kierującej rozwojem pęcherzyka 5. Wcześniej pęcherzyki z sukcesem hodowano w alginianie, obojętnym polisacharydzie pochodzenia glonowego, który żeluje w obecności jonów wapnia6-8. Hydrożele alginianowe tworzone w stężeniu 0,25% w/v okazały się najbardziej sprzyjające hodowli pęcherzyków i pozwoliły na zachowanie najwyższej zdolności rozwojowej 9. Hydrożele alginianowe nie są degradowalne, w związku z czym wzrost średnicy pęcherzyka powoduje powstanie siły ściskającej, która może wpływać na jego wzrost10. Następnie opracowaliśmy system hodowli oparty na przenikającej się sieci fibrynowo-alginianowej (FA-IPN), w której mieszanina fibryny i alginianu żeluje się jednocześnie. Kombinacja ta zapewnia dynamiczne środowisko mechaniczne, ponieważ początkowo oba komponenty przyczyniają się do sztywności macierzy; jednak proteazy wydzielane przez rosnący pęcherzyk degradują fibrynę w macierzy, pozostawiając jedynie alginian jako wsparcie. W przypadku sieci IPN zawartość alginianu może zostać zredukowana poniżej 0,25%, co nie jest możliwe przy zastosowaniu samego alginianu 5. Dzięki temu, w miarę rozrastania się pęcherzyka, będzie on poddawany mniejszej sile ściskającej ze względu na zredukowaną zawartość substancji stałych. W niniejszej pracy opisujemy metodę enkapsulacji oraz system hodowli in vitro pęcherzyków jajnika w sieci FA-IPN. Dynamiczne środowisko mechaniczne naśladuje naturalne środowisko jajnika, w którym małe pęcherzyki znajdują się w sztywnej korze i przemieszczają się do bardziej podatnego rdzenia w miarę zwiększania swoich rozmiarów11. Komponent degradowalny może mieć krytyczne znaczenie dla wdrożenia klinicznego, aby umożliwić ponad 106-krotny wzrost objętości, jakiego ludzkie pęcherzyki zazwyczaj ulegają in vivo.

Opisano nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci interpenetrującej z fibryny i alginianu. System ten łączy wsparcie strukturalne z degradacją proteolityczną, aby wspierać rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu wytworzenia dojrzałych oocytów. Metoda ta może być stosowana do hodowli agregatów komórkowych w celu utrzymania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Pęcherzyk jajnikowy jest jednostką funkcjonalną jajnika, która wydziela hormony płciowe i wspiera dojrzewanie oocytu. Techniki hodowli pęcherzyków in vitro umożliwiają...

Niniejszy protokół opisuje nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w interpenetrującej sieci fibryno-alginowej do hodowli in vitro. Pęcherzyk wtórny składa się z centralnie położonego oocyta otoczonego kilkoma warstwami komórek somatycznych, które wspierają rozwój oocyta; enkapsulacja pęcherzyka i jego hodowla w środowisku trójwymiarowym umożliwiają wzrost pęcherzyka, wspierając jednocześnie komunikację między wieloma przedziałami komórkowymi i utrzymując sferyczną strukturę pęcherzyka. W pierwszym kroku niniejszego protokołu należy wyizolować pęcherzyki wtórne z jajników myszy w 16. dniu życia, stosując metodę kropelkową.Przepłucz i przenieś pęcherzyki do roztworu enkapsulacyjnego. Odessaj każdy pęcherzyk za pomocą pipety z roztworem alginianu fibrynogenu do roztworu trombiny z wapniem, a następnie pozwól kuleczkom sieciować w przypadku metody paraformy. Przenieś poszczególne pęcherzyki do kropel roztworu alginianu fibrynogenu na szklanym slajdzie powleczonym paraformą i dodaj roztwór trombiny, aby zainicjować sieciowanie F-A-I-P-N.Następnie przenieś enkapsulowane pęcherzyki do pożywki wzrostowej i wykonaj obrazowanie enkapsulowanego pęcherzyka w FA IPN. Ponieważ system t

a-method-for-ovarian-follicle-encapsulation-culture-proteolytically

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metoda enkapsulacji i hodowli mieszków jajnikowych w proteolitycznie rozkładalnym 3-wymiarowym układzie

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Ten film opisuje protokoły hermetyzacji kompleksów wzgórko-oocytów świń (COC) w kulkach fibrynowo-alginianowych w celu stworzenia hodowli 3D. Ten system dojrzewania in vitro utrzymuje normalną komunikację między komórkami, zapewniając dojrzewanie oocytów i zachowując ich żywotność.

Hodowla 3D COC świń: procedura kapsułkowania kompleksów oocytów cumulusa w kulkach hydrożelowych z polimeru fibrynowo-alginianowego

W tym filmie opisujemy protokół enkapsulacji oocytów świń w hydrofobowych mikrobioreaktorach.

System mikrobioreaktora z płynnego marmuru: protokół hodowli 3D do enkapsulacji oocytów świń

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Poznaj metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci fibrynowo-alginianowej. Technika ta wspiera dojrzewanie oocytów zachowując interakcje międzykomórkowe w hodowli in vitro.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Przeglądaj więcej filmów