Name: Niechirurgiczne wkraplanie dotchawicze myszom z analizą płuc i węzłów chłonnych drenujących płuca za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj niechirurgiczną metodę wkraplania do płuc myszy z analizą komórek odpornościowych i węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie migracji komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przed rozpoczęciem procesu należy przygotować i zgromadzić następujące elementy
<ol>
	<li>W celu zbudowania drewnianej platformy do unieruchomienia myszy podczas procedury należy zapoznać się z obrazami na rysunku 1a) i 1b).</li>
	<li>Mieszanina do trawienia węzłów chłonnych – HBSS + 1.25mg/ml kolagenazy typu IV lub 2.5 mg/ml kolagenazy D</li>
	<li>Mieszanina do trawienia płuc – HBSS + 1 mg/ml kolagenazy</li>
	<li>Rozcieńczyć kulki lateksowe (1:20) w PBS do wstrzyknięcia doprzewnow brzusznego w celu wizualizacji LDLN</li>
</ol>
Uwaga: LDLN są małe i trudne do zlokalizowania. Aby nauczyć się je znajdować, należy wstrzyknąć myszy do jamy otrzewnowej (i.p.) 200μl czerwonych fluorescencyjnych kulek lateksowych rozcieńczonych w stosunku 1:20. Jama otrzewnowa drenuje do tych LDLN8. Po 24 hpi należy odsłonić jamę klatki piersiowej myszy zgodnie z powyższym opisem. LDLN będą miały różowy kolor dzięki kuleczkom, które spłynęły z jamy otrzewnowej.
<ol start="5">
	<li>Bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC) - 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA w 1L dH20. Dostosować pH do 7.2-7.4 i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Sito do komórek 70μm lub 100μm</li>
	<li>Roztwór stokowy 0.5M EDTA, pH = 8.0</li>
	<li>HBSS bez CaCl2 i MgCl2</li>
	<li>Nożyczki i pęseta tępa</li>
	<li>Laryngoskop</li>
	<li>Igła do gavage (rozmiar 22 G) wygięta pod kątem (Rycina 2)</li>
	<li>Płyta styropianowa i szpilki do unieruchomienia myszy</li>
	<li>Waga elektroniczna</li>
	<li>Roztwór błękitu anilinowego - 10mg/ml w H2O</li>
</ol>
Uwaga: Rozwiązanie to zostanie wykorzystane do zademonstrowania techniki wstrzykiwania domięśniowego (i.t.).
2. Przygotowanie i podanie środka znieczulającego dla myszy
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę ksylazyny i ketaminy w sterylnym PBS w taki sposób, aby końcowe stężenia wynosiły odpowiednio 2mg/ml i 10mg/ml.</li>
	<li>Zważyć mysz na wadze elektronicznej.</li>
	<li>Obliczyć dawkę wymaganą dla każdej myszy. Podawać ksylazynę (2-4 mg/kg) i ketaminę (70-80 mg/kg) masy ciała, stosując odpowiednią objętość przygotowanej mieszaniny, i wstrzyknąć dostrytonalnie. Każda linia myszy może wymagać optymalizacji znieczulenia. Myszy, które otrzymały zbyt dużą dawkę środka znieczulającego, mogą wykazywać obniżoną częstotliwość oddychania, co może być śmiertelne po wprowadzeniu inokulum do płuc.</li>
	<li>Po 3-5 minutach obserwować mysz pod kątem działania środka znieczulającego. Sprawdzić następujące oznaki, aby potwierdzić pełne znieczulenie myszy:
		<ol>
			<li>Częstotliwość oddychania powinna ulec spowolnieniu.</li>
			<li>Mysz nie powinna prostować kończyny przedniej podczas podnoszenia za kark.</li>
			<li>Nie powinna wystąpić żadna reakcja po stymulacji kończyn tylnych. 
			Jeśli kryteria te nie zostaną spełnione, odczekać kilka minut i sprawdzić ponownie przed przejściem do następnego kroku.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
3. Iniekcja dokanałowa (dotchawicza)
<ol>
	<li>Przygotować inokulum w 50μl soli fizjologicznej. Napełnić strzykawkę 1ml wyposażoną w sterylną, zagiętą igłę do zgłębnika inokulum. Strzykawka powinna zawierać 100μl poduszkę powietrzną za inokulum, aby zapewnić wprowadzenie całej cieczy do płuca.</li>
	<li>Umieścić mysz na skośnej drewnianej platformie, zawieszając ją za siekacze na drucie, a następnie delikatnie przymocować ją w tej pozycji za pomocą kawałka wstążki.</li>
	<li>Włączyć laryngoskop lewą ręką (jeśli pracuje się prawą ręką) i chwycić pęsetę z tępymi końcami. Używając końcówki laryngoskopu i pęsety, delikatnie rozwarte usta.</li>
	<li>Za pomocą pęsety wyciągnąć język i odsunąć go na bok. Przesunąć ostrze laryngoskopu w stronę tylnej części jamy ustnej. Delikatnie dociskać laryngoskop pod kątem 90°, aż do momentu zobaczenia otworu tchawicy. Przytrzymać laryngoskop w tej pozycji. Należy zachować ostrożność podczas wyciągania języka z pyszczka i robić to delikatnie, aby nie uszkodzić tkanek.</li>
	<li>Drugą ręką chwycić strzykawkę 1ml z inokulum, wyposażoną w zagiętą igłę do zgłębnika, i wprowadzić igłę do tchawicy, aż zagięcie igły znajdzie się przy przednich siekaczach. Równomiernie nacisnąć tłok, aby podać inokulum. Inokulum nie powinno pienić się. Jak najszybciej wyciągnąć igłę z tchawicy. Myszy uduszą się i zginą, jeśli tchawica będzie zablokowana zbyt długo. Trzymać mysz w pozycji pionowej przez kilka sekund, aby umożliwić wchłonięcie inokulum do płuc.</li>
	<li>Zdjąć mysz z platformy i umieścić ją w pobliżu lampy grzewczej. Nie pozostawiać myszy pod bezpośrednim wpływem ciepła przez dłuższy czas. Mysz powinna całkowicie się obudzić w ciągu 30 min po zabiegu (czas rekonwalescencji może się różnić w zależności od szczepu). Podczas tego czasu należy uważnie obserwować myszy i nie dopuścić do ich przegrzania lub wychłodzenia, ponieważ mogłoby to doprowadzić do niewydolności oddechowej i śmierci zwierząt.</li>
</ol>
4. Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych drenażowych płuc oraz płuc do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Uśmierć myszy wybraną metodą zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji. Może to zależeć od indywidualnych wyników pobierania organów. Przykładem odpowiedniej procedury eutanazji jest podanie śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu. Nie zaobserwowano negatywnego wpływu eutanazji za pomocą CO2 na płuca.</li>
	<li>Przytwierdź kończyny do deski sekcyjnej szpilkami. Nożyczkami wykonaj nacięcie wzdłuż środka strony brzusznej. Delikatnie odsun skórę, aby odsłonić mięśnie ściany klatki piersiowej.</li>
	<li>Wykonaj nacięcia przez mięśnie ściany klatki piersiowej, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.</li>
	<li>Uchwyć pęsetą czubek mostka i przebij przeponę. Przetnij przeponę wzdłuż klatek piersiowych.</li>
	<li>Trzymając nożyczki równolegle do powierzchni deski sekcyjnej, przetnij jamę klatki piersiowej wzdłuż linii grzbietowo-brzusznej po obu stronach.</li>
	<li>Lekko unieś klatkę piersiową. Po prawej stronie serca, tuż pod grasicą, zlokalizuj dwa węzły chłonne. Trzeci, nieco większy węzeł chłonny znajduje się pod małym naczyniem krwionośnym tętniczym, biegnącym prostopadle do tchawicy. Pobierz węzły chłonne do 1 ml mieszaniny do trawienia węzłów chłonnych.</li>
	<li>Po pobraniu węzłów chłonnych przytrzymaj serce jedną pęsetą, a płuca chwyć drugą. Pobierz płuca do 3 ml lodowatego PBS w płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Rozdziel płaty płuc, odessaj PBS i posiekaj płaty na małe kawałki za pomocą pęsety i nożyczek. Dodaj 3 ml mieszaniny do trawienia płuc. Podczas tego etapu trzymaj płytkę 6-dołkową na lodzie.</li>
	<li>Inkubuj węzły chłonne przez 25-30 min, a płuca przez 30 min w temperaturze 37°C. Do każdej z mieszanin trawiennych dodaj EDTA do stężenia końcowego 10mM, aby zatrzymać reakcję, a następnie umieść na lodzie.</li>
	<li>Używając strzykawki 3 ml, przeciągnij kawałki płuc przez igłę 18GA 3 razy. Rozetrzyj kawałki płuc oraz węzły chłonne przez sitka komórkowe 70-100μm, używając tłoka strzykawki 1 ml. Przepłucz sitka komórkowe 10 ml HBSS bez Ca2+ i Mg2+. Centryfuguj przy 500 x g przez 5 min.</li>
	<li>Resuspenduj osad w 5 ml buforu do lizy RBC i inkubuj przez 3 min w temperaturze pokojowej. Dodaj 10 ml HBSS bez Ca2+ i Mg2+, aby przerwać lizę. Centryfuguj przy 500 x g przez 5 min. Doprowadź zawiesiny pojedynczych komórek płuc i LDLN do objętości odpowiednio 10 ml i 5 ml. Policz żywe komórki za pomocą hemacytometru metodą wykluczania błękitu trypanu. Komórki są teraz gotowe do barwienia przed cytometrią przepływową. Jeden płat płuca może być wystarczający do cytometrii przepływowej. Pozostałe płaty można wykorzystać do innych celów eksperymentalnych u tej samej myszy, np. do przygotowania homogenatów w celu oznaczenia cytokin lub do badań histologicznych.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Komórki dendrytyczne płuc (LDC) oraz makrofagi pęcherzykowe w płucach pobierają antygen z przestrzeni pęcherzykowych płuc bezpośrednio po iniekcji i.t. 
Rycina 3 przedstawia odsetek komórek CD11c+ (wyrażanych na LDC i makrofagach pęcherzykowych), które są dodatnie pod kątem fluorescencyjnie znakowanych przetrwalników Bacillus anthracis, 
30 min po iniekcji i.t. W tym czasie ~15,9% komórek CD45+CD11c+ w zawiesinie pojedynczych komórek płuc zawierało przetrwalniki Bacillus anthracis (Rycina 3, dolne
 panele). W celu dalszej charakterystyki komórek CD11c+ w płucach należy odnieść się do pracy Kim i Braciale4. Fluorescencyjnie znakowane kuleczki są rutynowo stosowane do oceny 
transportu antygenów cząsteczkowych do LDLN9. Aby ocenić ten transport z płuc do LDLN, wstrzyknięto i.t. fluorescencyjne kuleczki lateksowe wraz z LPS, a następnie przeanalizowano LDLN 
w 24 hpi. Około 4% komórek CD11chi w LDLN zawierało fluorescencyjne kuleczki w 24 hpi (Rycina 4). Te reprezentatywne eksperymenty pokazują, że 
niniejszy protokół może być efektywnie wykorzystany do śledzenia komórek, które pobierają wdychane antygeny cząsteczkowe w płucach, a następnie transportują je do LDLN.

<img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Widok z przodu i z boku drewnianego zestawu do stabilizacji w pozycji statycznej z regulowanym paskiem; oznaczone wymiary." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Drewniana platforma do unieruchamiania myszy podczas wstrzykiwania do cisterny (i.t.). Drewniany blok został przycięty pod kątem i dopasowano do niego metalne pręty, widok z przodu rycina 1a) oraz widok z boku rycina 1b). Mały kawałek drutu owinięto wokół metalowego pręta, aby unieruchomić przednie siekacze myszy. Do platformy przymocowano kawałek wstążki, którą obwiązuje się mysz, aby utrzymać ją w miejscu podczas procedury.
<img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Typy igieł do chromatografii; dwie metalowe igły; stosowane do wstrzykiwania próbek; konstrukcje kątowe i proste." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Igła do gavage do iniekcji i.t. Igła do gavage (po prawej) została zgięta pod kątem ˜135° (po lewej) do iniekcji i.t. 

<img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Wykres cytometrii przepływowej ekspresji GFP w komórkach CD11c+; wyniki analizy PBS vs. przarodniki GFP-BA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Procent wszystkich komórek CD11c+ w płucach zawierających wstrzyknięte drogą i.t. GFP-ekspresyjne Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), 5h po ekspozycji. Myszy AJ poddano ekspozycji na 1x108 przarodników GFP- Bacillus anthracis, a płuca przeanalizowano 5h po infekcji. Wykresy kropkowe przedstawiają procent komórek CD11c+ w płucach, które są dodatnie w kierunku Bacillus anthracis.
<img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej pokazujący wychwyt fluorescencyjnych kulek w komórkach CD11c^hi po podaniu PBS oraz LPS+FITC." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Detekcja fluorescencyjnych kulek (żółto-zielonych) w węzłach chłonnych odtaczających płuca 24 godziny po wstrzyknięciu i.t. Myszy AJ otrzymały albo PBS (panel lewy), albo 5x109 mikrosfer Fluoresbrite YG (0.5μm) z 10μg LPS (panel prawy) drogą i.t., a węzły chłonne odtaczające płuca (LDLNs) przeanalizowano 24hpi. Reprezentatywne wykresy kropkowe przedstawiają procent komórek CD11chi w LDLNs zawierających fluorescencyjne kulki w odniesieniu do pustego kanału.

<ol><li>Grayson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+lung+dendritic+cell+maturation+and+migration+during+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection.</a> J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).</li>
<li>GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+between+dendritic+cell+subsets+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Division of labor between dendritic cell subsets of the lung.</a> Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).</li>
<li>Bar-Haim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationship+between+dendritic+cell+trafficking+and+Francisella+tularensis+dissemination+following+airway+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection.</a> PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).</li>
<li>Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dendritic+cell+subsets+differ+in+their+capacity+to+support+the+induction+of+virus-specific+cytotoxic+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses.</a> PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).</li>
<li>Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+interaction+dynamics+during+the+induction+of+respiratory+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity.</a> J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+the+pathology+and+efficacy+of+vaccination+in+a+murine+model+of+inhalational+anthrax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax.</a> J Med Microbiol. , (2010).</li>
<li>Kiyono, H., Fukuyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALT-+versus+Peyer%27s-patch-mediated+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity.</a> Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).</li>
<li>Parungo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+drainage+of+the+peritoneal+space%3A+a+pattern+dependent+on+bowel+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics.</a> Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).</li>
<li>Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+methods+to+study+pulmonary+dendritic+cell+migration+reveals+distinct+capacities+of+DC+subsets+to+acquire+soluble+versus+particulate+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen.</a> J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).</li>
<li>Higgins, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+levels+of+M-CSF+and+GM-CSF+influence+the+specific+generation+of+macrophage+populations+during+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).</li>
<li>Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> J Exp Med. 205, 869-869 (2008).</li>
<li>Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transoral+tracheal+intubation+of+rodents+using+a+fiberoptic+laryngoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope.</a> Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).</li>
<li>Takahashi, S., Patrick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+to+individual+thoracic+and+cervical+lymph+nodes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat.</a> Lab Anim. 21, 31-31 (1987).</li>
<li>Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wykorzystaliśmy niniejszy protokół do badania transportu przetrwalników Bacillus anthracis z płuc do LDLNs. W podobnych zastosowaniach liczbę cząstek dostarczanych do płuc należy starannie dobrać tak, aby wstrzyknięty materiał można było wykryć w LDLNs za pomocą cytometrii przepływowej. Metodę tę z powodzeniem stosowaliśmy również do adoptywnego transferu komórek oraz znakowania specyficznych populacji komórek płuc z użyciem przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Ponadto metoda ta jest rutynowo wykorzystywana...

<table><tbody><tr><td>Sito do komórek 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błękit anilinowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A967-25</td><td></td></tr><tr><td>Igła do karmienia zwierząt</td><td>Popper &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Worthington Biochemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche Group</td><td>11088974103</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery Fluoresbrite YG (0,5&amp;mu;m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17152</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bez chlorku wapnia i chlorku magnezu</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl (100mg/ml)</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piórko laryngoskopu</td><td>PennCentury, Inc</td><td>Do modelu LS-1</td><td>Patrz &lt;a href=&quot;http://www.penncentury.com">www.penncentury.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Lekki laryngoskop światłowodowy</td><td>Welch Allyn</td><td>80814</td><td></td></tr><tr><td>Czerwone kuleczki fluorescencyjne (0,5&amp;mu;m)</td><td>Invitrogen</td><td>F8812</td><td>Do iniekcji d.o.</td></tr><tr><td>Ksylazyna (100mg/ml)</td><td>Lloyd, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Komórki fagocytarne, takie jak makrofagi pęcherzykowe i dendrytyczne komórki płucne (LDCs), nieustannie pobierają antygeny z przestrzeni pęcherzykowych w płucach. LDCs w szczególności migrują do drenujących płuca węzłów chłonnych (LDLNs), gdzie prezentują wdychane antygeny limfocytom T, inicjując odpowiednią odpowiedź immunologiczną na różnorodne immunogeny1,2. Aby zamodelować interakcje między płucami a antygenami przenoszonymi drogą powietrzną u myszy, antygeny można podawać donosowo1,3,4, wewnątrztchzewicznie5 lub w formie aerozoli6. Podawanie każdą z tych dróg wymaga odmiennych umiejętności technicznych i wiąże się z ograniczeniami, które należy rozważyć przed zaplanowaniem eksperymentu. Na przykład ekspozycja donosowa i aerozolowa dostarcza antygeny zarówno do płuc, jak i do górnych dróg oddechowych. W konsekwencji antygeny mogą dostać się do tkanki limfatycznej związanej z jamą nosową (NALT)7, co potencjalnie komplikuje interpretację wyników. Ponadto połykanie, kichanie i częstotliwość oddychania myszy mogą również prowadzić do niespójności w podawanych dawkach. Chociaż zaangażowanie górnych dróg oddechowych może być preferowane w niektórych badaniach, może ono utrudnić eksperymenty skupiające się na zdarzeniach inicjowanych specyficznie w płucach. W takim przypadku preferowana jest droga wewnątrztchzewicza (i.t), ponieważ dostarcza ona materiałów testowych bezpośrednio do płuc i omija NALT. Wiele protokołów iniekcji i.t. obejmuje albo ślepą intubację tchawicy przez jamę ustną, albo chirurgiczne odsłonięcie tchawicy w celu uzyskania dostępu do płuc. W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą, powtarzalną i niesurgicalną metodę instylacji i.t. Otwór tchawicy jest wizualizowany za pomocą laryngoskopu, a następnie zgięta igła do zgłębnika jest wprowadzana bezpośrednio do tchawicy w celu podania inokulum. Opisujemy również procedury pobierania i przetwarzania LDLNs oraz płuc w celu analizy transportu antygenów za pomocą cytometrii przepływowej.

Prezentujemy metodę niechirurgicznego podawania materiałów testowych do płuc znieczulonych myszy poprzez tchawicę. Metoda ta umożliwia ekspozycję płuc na patogeny bakteryjne i wirusowe, cytokiny, przeciwciała, koraliki, związki chemiczne lub barwniki. Ponadto opisujemy proces pobierania i przygotowania płuc oraz drenujących je węzłów chłonnych (LDLNs) do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Komórki fagocytarne, takie jak makrofagi pęcherzykowo-oszczękowe oraz dendrytyczne komórki płuc (LDCs), nieustannie pobierają antygeny z przestrzeni pęcherzykowych w płucach. LDCs, ...

Ogólnym celem tej procedury jest niechirurgiczne wprowadzenie materiału testowego do płuc myszy za pomocą igły do gavage oraz następująca analiza płuc i drenujących je węzłów chłonnych. Jest to realizowane poprzez wprowadzenie oświetlonego laryngoskopu i zgiętej igły do gavage do tchawicy znieczulonej myszy. Następnie materiał testowy jest podawany do płuc zwierzęcia za pośrednictwem laryngoskopu i igły do gavage.Następnie pobiera się płuca oraz drenujące je węzły chłonne. Na koniec płuca i węzły chłonne przetwarza się do postaci zawiesin pojedynczych komórek. Ostatecznie metoda ta umożliwia analizę cytometryczną przepływową w celu zbadania powiązania materiału testowego z komórkami odpornościowymi płuc oraz migracji komórek do drenujących płuca węzłów chłonnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekspozycja donosowa i aerozolowa, jest możliwość ukierunkowanego dostarczenia materiału badawczego do płuc z pominięciem tkanki limfatycznej związanej z jamą nosową. Ponadto jest ona prostsza w wykonaniu niż chirurgiczne przygotowanie szczurów do instylacji do tchawicy. Procedurę zaprezentują Elizabeth Enti, postdoc w laboratorium Richie'ego, oraz Manji, doktorantka w laboratorium lens.Po znieczuleniu myszy przygotować inokulum w 50 µL soli fizjologicznej. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml, wyposażoną w sterylną zagiętą igłę do zgłębnika, przygotowanym inokulum. Do strzykawki wprowadzić pęcherzyk powietrza o objętości 100 µL za inokulum, aby zapewnić wprowadzenie całej objętości płynu do płuca.Umieść mysz na nachylonej drewnianej platformie, aby zwisała za siekaczami na drucie, i delikatnie unieruchom ją w tej pozycji za pomocą kawałka tasiemki. Następnie jedną ręką włącz laryngoskop, a drugą chwyć pęsetę tępą. Używając końcówki laryngoskopu i pęsety, delikatnie rozewrzyj pyszczek za pomocą pęsety.Wyciągnij język i odsuń go na bok. Wprowadź ostrze laryngoskopu w kierunku tylnej części jamy ustnej. Dociskaj laryngoskop bardzo delikatnie pod kątem 90 stopni, aż do momentu, gdy pojawi się otwór tchawicy.Trzymając laryngoskop w miejscu jedną ręką, chwyć drugą ręką strzykawkę o pojemności 1 ml z przymocowaną zagiętą igłą do zgłębnika zawierającą inokulum. Wprowadź igłę do tchawicy tak, aby zagięcie igły znajdowało się na wysokości przednich siekaczy. Równomiernie pchnij tłok, aby podać inokulum bez tworzenia pęcherzyków powietrza.Jak najszybciej wyciągnij igłę z tchawicy. Trzymaj mysz w pozycji pionowej przez kilka sekund, aby inokulum mogło zostać wchłonięte do płuc. Umieść mysz w pobliżu lampy grzewczej i poczekaj, aż się obudzi.Po uśmierceniu zwierzęcia przypnij kończyny myszy do deski sekcyjnej. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie wzdłuż środkowej części strony brzusznej. Delikatnie odsun skórę i odsłoń otrzewną.Wykonaj nacięcia otrzewnej, aby odsłonić narządy jamy brzusznej. Chwyć końcówkę mostka pęsetą i przebij przeponę nożyczkami. Przetnij przeponę wzdłuż boków klatki piersiowej, prowadząc nożyczki równolegle do powierzchni stołu sekcyjnego.Należy wykonać niewielkie nacięcia jam klatki piersiowej wzdłuż linii grzbietowo-brzusznej po obu stronach. Unieś klatkę piersiową po prawej stronie serca. Bezpośrednio pod grasicą zlokalizuj dwa węzły chłonne.Trzeci, nieco większy węzeł chłonny znajduje się pod małym naczyniem krwionośnym tętniczym, które przebiega prostopadle do tchawicy. Pobierz węzły chłonne do 1 mL odczynnika do trawienia węzłów chłonnych, wymieszaj i umieść na lodzie. Po pobraniu węzłów chłonnych, pobierz płuca do płytki 6-dołkowej.Utrzymując płytkę sześciodołkową na lodzie, odessaj PBS i posiekaj płaty na małe kawałki za pomocą pęsety i nożyczek. Przytrzymaj każdy węzeł chłonny igłą 26 G i rozdziel go drugą igłą 26 G. Aby zapewnić uwolnienie wszystkich komórek, dodaj 3 mL mieszaniny do trawienia dla płuc oraz 1 mL dla węzłów chłonnych.Po inkubowaniu węzłów chłonnych przez 25 do 30 minut oraz płuc przez 30 minut w temperaturze 37 °C, do każdej z mieszanin trawiennych należy dodać EDTA do stężenia końcowego 10 mM w celu zatrzymania reakcji, a następnie umieścić je na lodzie. Za pomocą strzykawki 3 ml należy przepuścić fragmenty płuc przez igłę o rozmiarze 18 G. Fragmenty płuc oraz węzły chłonne należy trzykrotnie rozdrobić, przepuszczając je przez sita komórkowe o rozmiarze porów od 70 do 100 µm.Używając tylnej części tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, wypłucz sita do oddzielania komórek 10 ml HBSS bez wapnia i magnezu. Wirowarkuj próbki komórek z prędkością 500 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Resuspenduj osady w 5 ml buforu do lizy erytrocytów i inkubuj przez trzy minuty.W temperaturze pokojowej dodać 10 ml HBSS bez wapnia i magnezu, aby przerwać lizę, a następnie odwirować próbki przy 500 ×g przez pięć minut. Objętość zawiesin pojedynczych komórek z płuc oraz drenujących węzłów chłonnych płuc należy uzupełnić odpowiednio do 10 ml i 5 ml. Do zliczenia komórek należy wykorzystać błękit trypanowy i komorę licznikową typu hemocytometr.Na tych dwóch rysunkach myszy AJ zostały poddane ekspozycji na 1 × 10⁸ zarodników Bacillus anthracis, a płuca poddano analizie cytometrii przepływowej 30 minut po infekcji. Te wykresy kropkowe przedstawiają strategię bramkowania. Panele te pokazują procent komórek płuc CD45-dodatnich i CD11c-dodatnich, które są dodatnie pod kątem zarodników Bacillus anthracis.Na tej rycinie przedstawiono myszy szczepu AJ, którym wykonano wstrzyknięcia wewnątrz tchawicze, a następnie poddano analizie drenujące węzły chłonne płuc. Reprezentatywne wykresy kropkowe pokazują procent komórek CD 11 C high w drenujących węzłach chłonnych płuc, które zawierają fluorescencyjne kuleczki, wykreślony w odniesieniu do pustego kanału. Lewy panel przedstawia wyniki uzyskane u myszy, którym wstrzyknięto PBS, a prawy panel przedstawia wyniki uzyskane u myszy, którym wstrzyknięto 5×10⁹ jasnożółto-zielonych mikrosfer z 10 µg LPS.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak to, jakie zdarzenia są specyficznie inicjowane w płucach oraz w jaki sposób wdychane antygeny są transportowane z płuc do drenujących węzłów chłonnych.

non-surgical-intratracheal-instillation-mice-with-analysis-lungs-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niechirurgiczne wprowadzenie do tchawicy myszy z analizą płuc i limfatycznych węzłów drenujących płuca za pomocą cytometrii przepływowej

Użycie modelu, który naśladuje stan chorób płuc u ludzi, jest kluczowe dla badania patofizjologii i/lub etiologii danej choroby oraz dla opracowania interwencji terapeutycznej. W artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej, która może bezpośrednio dostarczać materiały egzogenne do płuc myszy.

Nieinwazyjna intubacja dotchawicza w celu zbadania patologii i fizjologii płuc myszy

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.

Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Celem tego artykułu jest opisanie prostych metod, które znacznie pomogą w konfiguracji i analizie płuc myszy z rakiem płuc lub innymi patologiami. Przedstawiamy 3 protokoły do prostego i niezawodnego przeprowadzania wkraplania płuc, stabilizacji i pomiarów objętości płuc.

Metody wkraplania i utrwalania przydatne w badaniach nad rakiem płuc myszy

Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.

Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Tutaj opisujemy minimalnie inwazyjny model syngenicznego przeszczepu ortotopowego komórek gruczolakoraka płuc myszy jako model redukujący czas i koszty do badania niedrobnokomórkowego raka płuc.

Ortotopowe przeszczepienie komórek syngenicznego gruczolakoraka płuc w celu zbadania ekspresji PD-L1

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków myszom często powoduje asymetryczne dostarczanie do dystalnych płuc. W tym raporcie opisujemy bezpośrednie podejście dooskrzelowe (IB) do kanniulacji każdego płuca u żywych myszy bez operacji. To podejście może być stosowane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub może być dostosowane do poprawy symetrycznego dostarczania środka do obu płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.

Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy

Model mysiego przeszczepu wewnątrzpłucnego tchawicy (IPTT) jest cenny do badania choroby zarostowej dróg oddechowych (OAD) po przeszczepie płuc. Oferuje wgląd w specyficzne dla płuc zachowania immunologiczne i angiogenne w znoszeniu dróg oddechowych po allotransplantacji z wysoką odtwarzalnością. W tym miejscu opisujemy procedurę IPTT i jej oczekiwane efekty.

Mysi przeszczep wewnątrzpłucnej tchawicy: model do badania choroby zarostowej dróg oddechowych po przeszczepie płuc

Poznaj niechirurgiczną metodę wkraplania do płuc myszy z analizą komórek odpornościowych i węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie migracji komórek immunologicznych.

Niechirurgiczne wkraplanie dotchawicze myszom z analizą płuc i węzłów chłonnych drenujących płuca za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów