Name: Chirurgiczny przeszczep mysich nerwowych komórek macierzystych do rdzenia kręgowego myszy zakażonych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu komórek macierzystych do rdzenia kręgowego myszy zakażonych wirusem JHMV. Technika ta umożliwia badanie remielinizacji i terapii zastępczej w modelu stwardnienia rozsianego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór ksylazyny i ketaminy (ketamina jest substancją kontrolowaną. Należy prowadzić szczegółową dokumentację, a roztwory przechowywać w bezpiecznym, zamkniętym miejscu).</li>
	<li>Oczyść i wysterylizuj sprzęt.</li>
	<li>Przygotuj obszar operacyjny, przecierając go środkiem aseptycznym, a następnie przykrywając sterylnymi ręcznikami papierowymi, i skonfiguruj mikromanipulator.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do przeszczepu
<ol>
<li>Komórki należy resuspender do stężenia 10 0 cells/µl i, mimo że na każdą mysz transplantuje się jedynie 250 00 komórek, wymagana jest nadwyżka komórek na potrzeby napełniania strzykawki (należy przygotować co najmniej 30 0 komórek na każdą mysz otrzymującą komórki).</li>
<li>Komórki przeznaczone do transplantacji należy przemyć 3 razy w HBSS w 50 ml probówce stożkowej. Należy policzyć komórki przed ostatnim wirowaniem.</li>
<li>Po ostatnim wirowaniu należy odlać HBSS i pozostawić probówkę w pozycji odwróconej, aby zapobiec przedostaniu się kropel do pelletu.</li>
<li>Wewnętrzne ścianki należy osuszyć sterylną chusteczką Kimwipe poddaną działaniu promieni UV. Nie wolno dopuścić do wysuszenia pelletu.</li>
<li>Trzymając probówkę pionowo, należy powoli i bardzo delikatnie resuspender komórki w połowie końcowej pożądanej objętości HBSS.</li>
<li>Całkowitą objętość należy zmierzyć, pobierając większość zawiesiny do końcówki pipety, a następnie regulując pokrętło pipety, aż cała zawiesina znajdzie się w końcówce. Pozwoli to określić, ile dodatkowego HBSS jest potrzebne do uzyskania pożądanej koncentracji.</li>
<li>Objętość należy uzupełnić do pożądanej ilości, dodając HBSS.</li>
<li>Próbkę należy ponownie umieścić na lodzie. Jeśli komórki muszą pozostawać na lodzie dłużej niż 2 h, należy sprawdzić ich żywotność.</li>
</ol>
3. Przygotowanie myszy do operacji i transplantacji
<ol>
	<li>Zanurzyć mysz w narkozie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie ketaminy (10mg/kg) i ksylazyny (10mg/kg) w dawkach ok. 10 μl lub równoważnego środka anestetycznego. Cała procedura, od przygotowania chirurgicznego do szycia, potrwa od 30 do 40 minut.</li> 
	<li>(Opcjonalnie: nakleić ponumerowaną, kolorową taśmę na ogon każdej myszy w celu zapewnienia identyfikacji)</li>
	<li>Ogolić grzbiet myszy od dolnej części pleców do karku, obejmując obszar o szerokości 2 cm po obu stronach linii środkowej, za pomocą trymera elektrycznego. Włosy należy ściąć jak najkrócej (może być konieczne kilkukrotne przejście po tym samym obszarze).</li>
	<li>Aby usunąć pozostałe włosy, nałożyć cienką warstwę kremu do depilacji (Nair) za pomocą aplikatora z gazy.</li>
	<li>Po 1-2 minutach usunąć preparat Nair gazą lekko zwilżoną wodą z mydłem. Przygotowany obszar powinien stanowić czystą, gołą skórę, pozbawioną pojedynczych włosków, które mogłyby dostać się do rany podczas następnego etapu procedury chirurgicznej. 
Zdezynfekować przygotowany obszar roztworem jodku.</li>
</ol>
4. Laminektomia
<ol>
	<li>W trakcie procedury należy często zmieniać i/lub sterylizować rękawiczki. Umieść mysz na grzbiecie z głową skierowaną w lewo (jeśli jesteś praworęczny). Przykryj zwierzę sterylnym materiałem tak, aby odsłonięty był tylko ogolony obszar. Wykonaj nacięcie pionowe (˜1,3 cm) nad miejscem laminektomii, rozciągając je od około ósmego do dwunastego kręgu piersiowego (T8–T12).</li>
	<li>Trzymając pęsetę Graefe w lewej ręce, mocno uchwyć kręgosłup na poziomie T9 (Rycina 1A) i unieś mysz, aby zwiększyć krzywiznę kręgosłupa.</li>
	<li>Używając skalpela, nacinaj połączenie między kręgami T10 a T1, w przestrzeni między dwoma wyrostkami kolczystymi. Dalszo odsłoń to połączenie, ostrożnie usuwając warstwę mięśniową, aby odsłonić kość (patrz Rycina 1B,C).</li>
	<li>Używając nożyczek, usuwaj dalej mięśnie z okolic łuków kręgowych i nasad wyrostków za pomocą małych nacięć. Pozwoli to na stworzenie niewielkiej przestrzeni między kręgami. Powoli i delikatnie wprowadź jedno ostrze nożyczek w tę szczelinę i przetnij nasadę. Upewnij się, że zakrzywienie nożyczek jest zawsze skierowane bocznie, z dala od rdzenia. Powtórz czynność po drugiej stronie (patrz Rycina 1D,E).</li>
	<li>Unieś łuk kręgowy, aby odsłonić rdzeń, a następnie ostrożnie go odetnij. Upewnij się, że nie pozostały żadne luźne lub poszarpane fragmenty kostne (patrz Rycina 1F).</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem usuń krew za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych.</li>
</ol>
5.	Iniekcja komórek
<ol>
<li>Przymocuj igłę wraz z nakrętką do strzykawki Hamiltona i oczyść je, przepłukując kilka razy wodą, następnie 70% etanolem, a na koniec HBSS. Po każdym napełnieniu wodą, 70% etanolem lub HBSS wsuń tłok.</li>
<li>Przygotuj strzykawkę Hamiltona do załadunku komórek, wyjmując tłok, luzując nakrętkę i odsuwając igłę od strzykawki, aby zapobiec przeciwciśnieniu. Upewnij się, że manipulacje przy igle i nakrętce są wykonywane w sterylnych rękawiczkach.</li>
<li>Naciągnij 15μl zawiesiny komórek do końcówki pipety i mocno dociśnij końcówkę do tylnej części strzykawki, aby wprowadzić komórki do jej wnętrza.</li>
<li>Wsuń tłok na około 5mm, a następnie dokręć nakrętkę igły.</li>
<li>Wciśnij tłok, aż część zawiesiny komórkowej zacznie wypływać przez igłę.</li>
<li>Upewnij się, że w strzkawce nie ma pęcherzyków powietrza i połóż ją w pozycji poziomej, aby zapobiec sedymentacji komórek pod wpływem grawitacji.</li>
<li>Uchwyć mysz po laminektomii za mięsień grzbietowy (spinalis dorsi) w obrębie wyrostków kolczystych kręgów T8 i T9 (Rysunek 2B, C).</li> 
<li>Przymocuj kleszczyk hemostatyczny do lewego (pionowego) ramienia mikromanipulatora w taki sposób, aby przednie łapy myszy znajdowały się w powietrzu, a tylne lekko dotykały platformy z jałowych ręczników papierowych, jak pokazano na Rysunkach 2A i 2B.</li>
<li>Przymocuj strzykawkę do prawego ramienia mikromanipulatora (pod kątem 70°) i przesuń ją do najniższej możliwej pozycji przed zaciśnięciem zacisku.</li>
<li>Ustabilizuj mysz, przypinając jej ogon do ręczników papierowych, i powoli opuszczaj strzykawkę (Rysunek 2B).</li>
<li>Opuść igłę w kierunku rdzenia i wprowadź ją na 1mm do przeciwległej półkuli przez linię środkową grzbietową (Rysunek 2C). Koniec igły powinien znajdować się w istocie szarej w pobliżu kanału centralnego.</li>
<li>Powoli wstrzyknij 2,5μl komórek. Wstrzykiwanie wykonuj z prędkością 1μl / 5 sekund. Po wstrzyknięciu komórek odczekaj 10 sekund, a następnie wycofuj igłę o jedną dziesiątą obrotu co 10 sekund, aż zostanie całkowicie wyjęta z rdzenia. Zwróć uwagę na ewentualny wypływ zawiesiny komórkowej.</li>
<li>Szybko wycofaj strzykawkę i odłącz ją od ramienia mikromanipulatora. Połóż strzykawkę poziomo.</li>
<li>Zwolnij uchwyt myszy i przenieś ją na stół do szycia.</li>
<li>Powtarzaj kroki 5.7–5.14 dla każdej myszy, aż strzykawka zostanie opróżniona. Sterylizuj narzędzia (w sterylizatorze) oraz igłę (przecierając etanolem) pomiędzy zwierzętami. W razie zauważenia agregacji komórek, wylej zawartość i napełnij strzykawkę ponownie.</li>
<li>Czyść strzykawkę zgodnie z instrukcją w kroku 5.1 pomiędzy kolejnymi załadunkami.</li>
</ol>
6. Szwy i opieka pooperacyjna
<ol>
<li>Zaszyj nacięcie. Igłę chirurgiczną wprowadź w powięź powierzchowną po obu stronach nacięcia. Przewlecz nić, zbliżając do siebie powięź powierzchowną (Ryc. 3A), aby przykryć odsłonięty rdzeń kręgowy w miejscu usuniętej blaszki łukowej. Nie zaszywaj mięśni skórnych przytwierdzonych do skóry ani mięśni szkieletowych grzbietu. Przeciągnij całą nić, pozostawiając około 1/2". Za pomocą uchwytu do igieł zawiąż trzy węzły i odetnij nić jak najbliżej węzła.</li>
<li>Zamknij nacięcie, zakładając dwa do trzech zszywek (w zależności od wielkości nacięcia) na skórze (Ryc. 3B). Ostrożnie odciągnij skórę od myszy, aby uniknąć zszycia leżącego poniżej mięśnia.</li>
 <li>Za pomocą igły 26G3/8 wstrzyknij 0,5ml Lactated Ringers podskórnie w dolnej części grzbietu, w miejscu oddalonym od nacięcia.</li>
<li>Umieść mysz z powrotem w klatce. Aby zapewnić zwierzęciu swobodne oddychanie podczas działania anestezji, mysz należy położyć w klatce na boku, unikając kontaktu miejsca operowanego z podścieliskiem. Klatki powinny być umieszczone na matach grzewczych.</li>
<li>Monitoruj myszy po ustąpieniu działania anestezji, aby upewnić się, że krwawienie ustało, szwy pozostają nienaruszone, a zwierzęta odzyskały sprawność ruchową sprzed operacji.</li>
<li>Po zabiegu podaj myszom jednorazowo lek przeciwbólowy buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg).</li>
<li>Zapewnij myszom z ograniczoną sprawnością odpowiedni dostęp do pokarmu i wody: butelki z wodą należy wyposażyć w wydłużone dysze o długości 3,5 cala, a myszom, które nie mogą chodzić, należy podawać wodę i/lub wysokokaloryczny suplement diety (Nutri-Cal, Tomlyn) ręcznie.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Pożądane wyniki będą możliwe do zidentyfikowania po braku wycieku zawiesiny komórkowej podczas wstrzykiwania oraz po zachowaniu nienaruszonego wyglądu rdzenia kręgowego po zakończeniu procedury. W tym celu niezbędne jest zapewnienie jasnego i bezpośredniego oświetlenia kręgosłupa myszy podczas laminektomii oraz w trakcie wstrzykiwania. Optymalne oświetlenie jest możliwe dzięki zastosowaniu oświetlenia światłowodowego (Rysunek 2A).
<img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Proces operacyjny u gryzoni, odsłonięcie rdzenia kręgowego, schemat ilustrujący metodę eksperymentalną i anatomię." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1- Laminektomia. (A) Po stabilnym uchwyceniu kręgu T9 kleszczykami Graefe (B, C) naciąć kręgosłup skalpelem pomiędzy T10 a T1, aby ułatwić wprowadzenie mikronozyczek. (D) Ostrożnie przesunąć mikronozyczki przez przestrzeń między T10 a T1 (strzałki i wstawka, E) i przeciąć nasady łuków po obu stronach (kreski, E), aby uwolnić blaszkę łuku kręgu. (F) Odgiąć blaszkę w kierunku rostralnym i odciąć ją.
<img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Technika operacji mózgu u gryzoni; obrazowanie ustawienia stereotaktycznego oraz procesu odsłaniania kory." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Iniekcja NSC. (A) Ogólny układ mikromanipulatora z kleszczykami hemostatycznymi utrzymującymi mysz przymocowanymi do lewego ramienia oraz strzykawką Hamiltona na prawym ramieniu pod kątem 70°. (B) Kleszczyki hemostatyczne utrzymują mięsień plecy (*musculus spinalis dorsi*) łączący kolce wyrostków T8 i T9. (C) Igła jest wprowadzana w dół przez linię środkową do istoty szarej przeciwległej półkuli, proksymalnie względem kanału centralnego.
<img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Schemat techniki chirurgicznej zamykania rany u gryzoni za pomocą szwów i zszywek w celu naprawy tkanek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Szwy i zamknięcie rany. (A) Szwy zostają założone na powięź powierzchowną po obu stronach nacięcia. (B) Nacięcie zostaje zamknięte za pomocą 2–3 zszywek w zależności od potrzeb (na ranie wymagającej 3 zszywek pokazano jedną).

<ol><li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system%3A+host-virus+stand-off%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li>
<li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+multiple+sclerosis%3A+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li>
<li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+%28MHV-4%29%3A+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li>
<li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination%2C+axonal+sparing%2C+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li>
<li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li>
<li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li>
<li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlakemore%2C+WF+%22Transplantation+of+glial+cells+into+areas+of+demyelination+in+the+adult+rat+spinal+cord%22">Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord</a>. , Oxford UP. Oxford. (1992).</li>
<li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li>
<li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li>
<li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Prawidłowo wykonany przeszczep zależy przede wszystkim od starannego przeprowadzenia laminektomii oraz iniekcji komórek. Głównym błędem, którego należy uniknąć podczas laminektomii, jest uszkodzenie rdzenia kręgowego. Może ono nastąpić w trakcie samego zabiegu lub w wyniku obrażeń spowodowanych przez ostre fragmenty kości pozostawione po jego zakończeniu. Aby tego uniknąć, należy upewnić się, że ostrza zakrzywionych mikronozyczek są zawsze skierowane w stronę przeciwną do rdzenia, a następnie dokładnie zbadać laminektomizowany kręgosłup, aby upewnić się, że wszystkie fragmenty kostne zostały usunięte i że w pozostałej strukturze kręgów nie ma wyraźnie wystających lub poszarpanych krawędzi.
Jak wspomniano wcześniej, wykrycie wycieku będzie możliwe, jeśli światło będzie świecić mocno i bezpośrednio na odsłonięty rdzeń kręgowy podczas wstrzykiwania. Wyciek najczęściej występuje przy użyciu igieł o rozmiarze 30 G (w porównaniu do 33 G) oraz w przypadku zbyt szybkiego wstrzykiwania. Chociaż niniejszy protokół przyniósł nam dobre rezultaty, inni autorzy zgłaszali dłuższe okresy oczekiwania (do 5 minut) przed wycofaniem igły po wstrzyknięciu 8,9. Ponadto preferowane są igły o mniejszym rozmiarze, jednak zaobserwowaliśmy, że niektóre komórki ulegają zbyt łatwej lizie podczas przechodzenia przez igły o rozmiarze 33 G.
Aby zmaksymalizować wydajność, zaleca się powołanie zespołu transplantacyjnego obsługującego cztery różne stanowiska (przygotowanie myszy, laminektomia, iniekcja i szwy). Ponadto czas trwania każdej procedury powinien zostać zoptymalizowany tak, aby zminimalizować czas oczekiwania komórek w lodzie. Na przykład transplantujemy myszy w grupach po cztery (liczba dawek w jednym napełnieniu strzykawki); osoba wykonująca iniekcje komórek rozpoczyna napełnianie strzykawki po wykonaniu laminektomii u trzeciej myszy, a osoba przygotowująca zwierzęta powinna podać znieczulenie kolejnej grupie po laminektomii drugiej myszy z poprzedniej grupy. W ten sposób możemy przeprowadzić transplantację komórek (lub medium kontrolnego) u 40 myszy w około 3 h, mimo że każda mysz wymaga około 30-40 min.
Terapie zastępcze komórek w leczeniu niektórych schorzeń OUN znajdują się obecnie w fazie badań klinicznych 10. Nie ma zamiennika dla modeli in vivo transplantacji NSC, a nasz protokół wszczepiania NSC do rdzeni kręgowych myszy z wirusowo indukowaną demielinizacją ułatwia wykorzystanie istotnego modelu SM i może być również łatwo dostosowany do innych modeli.

<table><tbody><tr><td>Ketaject</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>NDC 57319-542-02</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyny chlorowodorek</td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Kościół &amp;amp; Dwight Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;Strzykawka Hamilton z wymienną igłą</td><td>Hamilton Co</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>igły Hamilton, 30G lub 33G, &amp;frac12; cal, 30&amp;#x00B0; ścięcie </td><td>Hamilton Co</td><td>7803-077803-05</td><td>Przetestuj żywotność komórek po przepuszczeniu ich przez igły, aby zidentyfikować optymalny rozmiar igły do zastosowania</td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>555500S</td><td></td></tr><tr><td>Małe kleszczyki Graefego</td><td>Fine Science Tools</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny</td><td>Kopf Instruments</td><td>Uniwersalny uchwyt model 1772</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny</td><td>Kopf Instruments</td><td>Uchwyt do elektrod Model 1773</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny</td><td>Kopf Instruments</td><td>Steryotaksometr dla małych zwierząt model 902</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny</td><td>Kopf Instruments</td><td>Uchwyt lewej elektrody modelu 960</td><td></td></tr><tr><td>Szwy</td><td>Ethicon Inc.</td><td>95057-064</td><td></td></tr><tr><td>roztwór Ringera z mleczanem</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-7953-03</td><td></td></tr><tr><td>Zszywki</td><td>Fine Science Tools</td><td>12032-07</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13010-12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele, rozmiary 10, 11</td><td>Fisher Scientific</td><td>268878, 268879</td><td></td></tr><tr><td>Szycie chirurgiczne</td><td>Ethicon Inc.</td><td>1676G</td><td>rozmiar 5-0, 3/8&quot; okrąg, igła 19 mm, pleciona nić 45 cm</td></tr><tr><td>Aplikator do klipsów ranowych Reflex 7</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do ran Reflex 7 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12032-07</td><td></td></tr><tr><td>potrzymywacz igieł Olsen-Hegar</td><td>Fine Science Tools</td><td>12502-12</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgiczna transplantacja neuralnych komórek macierzystych myszy do rdzeni kręgowych myszy zainfekowanych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Myszy zakażone neurotropowym szczepem JHM wirusa zapalenia wątroby myszy (MHV) wykazują zmiany patologiczne i wyniki kliniczne podobne do tych u pacjentów z demielinizującą chorobą, jaką jest stwardnienie rozsiane (SM). Wykazaliśmy, że transplantacja NSC do rdzeni kręgowych chorych myszy prowadzi do znaczącej poprawy zarówno w zakresie remielinizacji, jak i wyników klinicznych. Terapie zastępcze komórkami w leczeniu przewlekłych chorób neurologicznych są obecnie rzeczywistością, a modele in vivo są kluczowe dla zrozumienia interakcji między przeszczepionymi komórkami a mikrośrodowiskiem tkanki gospodarza. Niniejsza prezentacja przedstawia dostosowaną metodę transplantacji komórek do rdzenia kręgowego myszy zakażonych JHMV. W skrócie przedstawiamy procedurę obejmującą: i) przygotowanie NSC przed transplantacją, ii) opiekę przedoperacyjną nad myszami, iii) odsłonięcie rdzenia kręgowego poprzez laminektomię, iv) stereotaktyczne wstrzyknięcie NSC oraz iv) opiekę pooperacyjną.

Szczegółowo opisano transplantację mysich komórek macierzystych neuronów (NSCs) do rdzenia kręgowego myszy z utrwaloną demielinizacją. Przedstawiono przygotowanie NSCs, laminektomię dziewiątego kręgu piersiowego (T9) oraz transplantację NSCs, wraz z opieką przed- i pooperacyjną nad myszami.

Chirurgiczna transplantacja neuralnych komórek macierzystych myszy do rdzeni kręgowych myszy zainfekowanych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy

Myszy zakażone neurotropowym szczepem JHM wirusa zapalenia wątroby myszy (MHV) wykazują zmiany patologiczne i objawy kliniczne podobne do tych u pacjentów z...

Ogólnym celem tej procedury jest promowanie remielinizacji i poprawy stanu klinicznego u zwierząt z utrwaloną demielinizacją poprzez transplantację neuralnych komórek macierzystych do rdzenia kręgowego myszy zainfekowanych JHMV. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie zwierzęcia. Drugim krokiem procedury jest wykonanie laminektomii na poziomie kręgów piersiowych.Następnie do odsłoniętego rdzenia kręgowego wstrzykuje się 10 komórek. Po pomyślnym wykonaniu iniekcji ranę zamyka się. Ostatecznie stwierdza się obecność mysich komórek macierzystych układu nerwowego w rdzeniu kręgowym.Miąższ można wizualizować za pomocą takich metod jak mikroskopia fluorescencyjna, transplantacja neuronalnych komórek macierzystych do rdzenia kręgowego JHMB. Zainfekowane myszy mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie terapii zastępczych komórek w leczeniu chorób demielinizacyjnych, takich jak sposób, w jaki komórki migrują, proliferują i różnicują się, a także w jaki sposób wpływają one na ośrodkowy układ nerwowy. Można również badać, czy modyfikacja komórek lub środowiska rdzenia kręgowego, do którego są one transplantowane, pozwoli na zwiększenie ich korzyści terapeutycznych.Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat terapii zastępczej komórek w wirusowym modelu demielinizacji, można ją również zastosować w innych modelach demielinizacji i uszkodzeń, takich jak eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, EAE, oraz urazy rdzenia kręgowego. Przed przygotowaniem komórek do iniekcji należy przygotować wszystkie niezbędne roztwory. Następnie należy oczyścić i wysterylizować cały sprzęt.Przygotuj pole operacyjne i ustaw mikromanipulator, aby przygotować komórki do transplantacji za pomocą trypsyny, a następnie zawieś je w 50 ml probówce stożkowej. Przemyj komórki przeznaczone do transplantacji trzykrotnie w HBSS. Policz komórki przed końcowym wirowaniem.Po końcowym wirowaniu odlej HBSS i pozostaw probówkę w pozycji odwróconej, aby zapobiec przedostawaniu się kropel do osadu. Osusz wewnętrzne ścianki za pomocą sterylnej chusteczki Kim wipe naświetlonej promieniowaniem UV. Nie dopuść do wyschnięcia osadu.Trzymając probówkę pionowo, powoli i bardzo delikatnie resuspender komórki w połowie końcowej pożądanej objętości HBSS. Ostatecznie komórki powinny osiągnąć stężenie 100 000 komórek na mikrolitr.Zmierz całkowitą objętość, pobierając zawiesinę do końcówki pipety, a następnie regulując pokrętło pipety tak, aby cała zawiesina znajdowała się w końcówce. Pozwoli to określić, ile dodatkowego HBSS jest potrzebne do uzyskania pożądanej koncentracji. Uzupełnij objętość zawiesiny komórkowej do wymaganej wartości.Poprzez dodanie HBSS. Można przenieść komórki do probówki typu Eppendorf. Ponownie umieścić je w lodzie.Jeśli komórki muszą pozostawać w lodzie przez ponad dwie godziny, należy sprawdzić ich żywotność. Przed rozpoczęciem procedury chirurgicznej potwierdzić odpowiedni poziom znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palca. Za pomocą trymera elektrycznego ogolić grzbiet myszy, od dolnej części pleców aż do karku.Po ogoleniu obszaru należy nałożyć cienką warstwę kremu do depilacji, aby usunąć pozostałości włosów. Po jednej lub dwóch minutach należy przemyć obszar suchą gazą, a następnie gazą lekko nasączoną wodą z mydłem. Pole operacyjne powinno być teraz całkowicie pozbawione włosów.Na koniec wysterylizuj przygotowany obszar roztworem Betadinu i nałóż maść do oczu. Aby uniknąć wysychania, ułóż mysz grzbietem do góry. Wykonaj nacięcie nad miejscem laminektomii, rozciągając je od okolic kręgów piersiowych.T 8 do T 11. Zwiększ krzywiznę kręgosłupa i zlokalizuj T 10. Jest to pierwszy kręg z płaskim wyrostkiem i zazwyczaj znajduje się dwa kręgi rostralnie w stosunku do szczytu krzywizny kręgosłupa.Za pomocą szarych pęsety mocno unieruchom kręgosłup. Na poziomie T9 użyj skalpela, aby naciąć przestrzeń między dwoma wyrostkami kolczystymi T10 i T11. Następnie zdrap warstwę mięśniową, aby odsłonić znajdującą się pod nią kość, upewniając się, że zakrzywienie nożyczek jest skierowane w stronę przeciwną do rdzenia.Powoli wprowadź jedno ostrze nożyczek między T 10 a T 11. Przesuń ostrze między rdzeniem a pedikułą T 10 i przetnij pedikułę. Powtórz czynność po drugiej stronie. Unieś blaszkę łuku, aby odsłonić znajdujący się pod nią rdzeń, i ostrożnie go odetnij.Należy upewnić się, że nie pozostały żadne wolne lub poszarpane fragmenty kości. Po usunięciu wszystkich fragmentów kości należy wytrzeć krew za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych. Następnie przygotować strzykawkę Hamiltona, mocując igłę za pomocą nakrętki.Włóż tłok i kilkakrotnie przepłucz wodą, a następnie 70% etanolem i HBSS po oczyszczeniu. Wyjmij tłok i poluzuj nakrętkę igły.Odsuń igłę od strzykawki, aby zapobiec powstaniu ciśnienia wstecznego. Podczas pobierania komórek wprowadź 15 µL zawiesiny komórkowej do strzykawki, mocno dociskając końcówkę pipety do tylnej części strzykawki. Wsuń tłok na około pięć milimetrów, a następnie mocno dokręć nakrętkę igły.Naciśnij tłok, aż część zawiesiny komórkowej wypłynie z igły. Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza, a następnie połóż strzykawkę poziomo, aby zapobiec sedymentacji komórek pod wpływem grawitacji. Powracając do zwierzęcia, użyj kleszczyków hemostatycznych, aby uchwycić mięsień wyprostny grzbietu (m. spinous doci) na poziomie S.Połączenie wyrostków kolczystych T8 i T9. Przymocuj kleszczyki hemostatyczne do lewego ramienia mikromanipulatora w taki sposób, aby przednie łapy myszy znajdowały się w powietrzu, a tylne łapy lekko dotykały platformy z jałowych ręczników papierowych.Przymocuj strzykawkę do prawego ramienia mikromanipulatora pod kątem 70 stopni i przesuń ją w możliwie najniższą pozycję przed zaciśnięciem zacisku. Ustabilizuj mysz, przytwierdzając jej ogon do ręczników papierowych. Powoli opuść igłę w kierunku rdzenia.Wprowadź końcówkę o jeden milimetr do przeciwległej półkuli przez linię środkową grzbietową. Końcówka igły powinna znajdować się w istocie szarej lub w jej pobliżu, ale nie w kanale centralnym. Powoli wstrzyknij 2,5 µL komórek z prędkością jednego µL na pięć sekund.Po wstrzyknięciu komórek odczekaj 10 sekund i wycofaj igłę. Wykonaj obrót o 1/10 obrotu. Wycofuj igłę w tym tempie co 10 sekund, aż zostanie całkowicie wyjęta z rdzenia.Zbyt szybkie wstrzykiwanie komórek lub zbyt gwałtowne wycofanie igły może spowodować cofnięcie zawiesiny komórkowej. W takim przypadku należy wykluczyć mysz z badania. Po wycofaniu igły z miejsca wkłucia należy ją szybko wyciągnąć i odłączyć strzykawkę od ramienia mikromanipulatora.Ponownie połóż mysz poziomo. Puść mysz i przenieś ją na stół do szycia. Powtarzaj tę procedurę dla każdej myszy, aż strzykawka zostanie opróżniona.W przypadku widocznego grudkowania należy usunąć komórki i napełnić strzykawkę ponownie, płucząc i czyszcząc ją pomiędzy kolejnymi napełnieniami. Po wstrzyknięciu zwierzę przenosi się w oddzielne miejsce w celu założenia szwów. Przewlecz igłę chirurgiczną przez powięź powierzchowną po obu stronach nacięcia.Przeciągnij szew, aby zbliżyć powięź i przykryć odsłonięty rdzeń kręgowy w miejscu usuniętej blaszki łukowej. Używając uchwytu do igieł i pęsety, zawiąż trzy węzły i odetnij nadmiar nici. Podczas odsuwania skóry myszy zazwyczaj wystarcza jeden szew.Aby uniknąć zszycia leżącego pod spodem mięśnia, zamknij nacięcie za pomocą dwóch lub trzech zszywek. Po zamknięciu rany wstrzyknij podskórnie 0,5 milliliters roztworu Ringer’a z mleczanem w dolną część pleców, ale z dala od miejsca nacięcia. Umieść mysz na boku w klatce, upewniając się, że miejsce operacji nie styka się z ściółką klatki.Monitoruj zwierzęta aż do pełnego powrotu do zdrowia. Na obrazie przedstawiono pomyślnie przeszczepione komórki macierzyste neuronów myszy znakowane GFP w przekroju wieńcowym rdzenia kręgowego. 21 dni po przeszczepie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą orientację w tym, jak przeszczepiać komórki macierzyste neuronów do rdzenia kręgowego myszy zainfekowanych JHMV. Po opanowaniu tej metody możliwe jest przeprowadzenie tej procedury u 40 myszy w około trzy godziny.

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Chirurgiczne przeszczepienie komórek macierzystych nerwowego uucha myszy do rdzeni kręgowych myszy zakażonych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy

Transplantacja prekursorów neuronalnych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych szyjnych neuronów ruchowych nerwu przeponowego w przypadku urazów rdzenia kręgowego (SCI) oraz w przebiegu stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), będącego chorobą neuronów ruchowych. Przedstawiamy protokół dostarczania komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego w gryzoniach w modelach ALS i SCI.

Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Źródło: Weber, R. Z., et al. Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje stereotaktyczny przeszczep genetycznie zmodyfikowanych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych (NPC) do mózgu myszy. Naukowcy wstrzykują NPC eksprymujące lucyferazy i białka fluorescencyjne, umożliwiając obrazowanie bioluminescencyjne in vivo i pośmiertną mikroskopię fluorescencyjną w celu zbadania przeżycia,...

Przeszczep ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Źródło: Furmanski, O., et al. Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)W tym filmie indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki nerwowe pochodzące z komórek macierzystych są stereotaktycznie wstrzykiwane do granicy istoty szarej i istoty białej kory głębokiej w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Przeszczepione komórki...

Stereotaktyczny przeszczep zawiesiny komórek nerwowych myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu

Ten film demonstruje donosowe dostarczanie terapeutycznych nerwowych komórek macierzystych załadowanych wirusem onkolitycznym do mysiego modelu z guzem mózgu. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg, ułatwiając ich dostarczenie do miejsca guza w mózgu w celu zastosowania terapeutycznego.

Donosowe dostarczanie terapeutycznych nerwowych komórek macierzystych (NSC) w modelu mysim: procedura ukierunkowanego na nowotwór dostarczania NSC załadowanych wirusem onkolitycznym do mysiego modelu zawierającego guz mózgu

Źródło: Parajuli, B., et.al. Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje przeznosowe przeszczepienie indukowanych pluripotencjalnych komórek ludzkiego mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu myszy. Hialuronidazę nakłada się na nozdrza myszy zubożonej w mikroglej w celu zwiększenia przepuszczalności.

Przeznosowe przeszczepienie indukowanych pluripotencjalnych ludzkich komórek mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek gleju do mózgu myszy

Tutaj prezentujemy nowy humanizowany model wątroby myszy wygenerowany u myszy z nokautem komórkowym za pośrednictwem receptora alb-toksyny (TRECK)/SCID po przeszczepie niedojrzałych i zdolnych do rozbudowy ludzkich komórek macierzystych wątroby.

Generowanie humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

Opisaliśmy protokół wykonywania częściowej hepatektomii (PHx) i przeszczepu komórek przez śledzionę w NOD. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) myszy. W tym protokole wykonuje się nacięcie w celu odsłonięcia i wycięcia lewego płata wątroby, a następnie kolejne nacięcie w celu dośledziony przeszczepu komórek.

Wewnątrzśledzionowe przeszczepienia hepatocytów po częściowej hepatektomii w NOD. Myszy SCID

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Obecny protokół opisuje rozwój powtarzalnego mysiego modelu glejaka rdzenia kręgowego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych do przestrzeni międzykręgowej, oferując bardziej efektywne i mniej inwazyjne podejście do badań i rozwoju terapeutycznego.

Chirurgiczny przeszczep komórek nowotworowych do rdzenia kręgowego myszy

Poznaj metodę przeszczepu komórek macierzystych do rdzenia kręgowego myszy zakażonych wirusem JHMV. Technika ta umożliwia badanie remielinizacji i terapii zastępczej w modelu stwardnienia rozsianego.

Chirurgiczny przeszczep mysich nerwowych komórek macierzystych do rdzenia kręgowego myszy zakażonych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy (Wideo) | JoVE Journal

Chirurgiczna transplantacja neuralnych komórek macierzystych myszy do rdzeni kręgowych myszy zainfekowanych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy

Przeglądaj więcej filmów