Name: Ex vivo Zakażenie żywych tkanek wirusami onkolitycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj metodę zakażenia świeżych tkanek chirurgicznych wirusem onkolitycznym vaccinia, oceny ich żywotności oraz monitorowania replikacji wirusowej. Protokół ten pomaga identyfikować pacjentów, którzy mogą odpowiedzieć na terapię wirusową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować dr. Heshamowi Abdelbary za udostępnienie ludzkich preparatów chirurgicznych do danych przedstawionych na Ryc. 2.

1. Obróbka tkanek
<ol>
<li>Aby uzyskać najlepsze wyniki, protokół ten należy przeprowadzić przy użyciu świeżo wyizolowanej tkanki umieszczonej w medium DMEM zawierającym 10% FBS, 1% roztworu penicyliny/streptomycyny oraz 0,1% roztworu amfoterycyny B bezpośrednio po operacji, przed procesowaniem. Jeśli nie jest to możliwe, tkanki można pozostawić w tym medium na noc w temperaturze 4 stopni przed procesowaniem.</li>
<li>Przed procesowaniem próbki należy wysterylizować metalowe pęsety i jednorazowe ostrza, umieszczając je w 70% roztworze etanolu przez co najmniej 5 minut. Należy również przygotować płytkę 24-dołkową z 2 ml medium DMEM zawierającego 10% FBS, 1% roztworu penicyliny/streptomycyny oraz 0,1% amfoterycyny B.</li> 
<li>Próbkę tkanki należy pobrać w laminarnym dygestorium do hodowli komórkowych za pomocą wysterylizowanych pęset i umieścić tkankę w pustej szalce Petriego o średnicy 15 cm, kładąc pokrywkę z boku, stroną sterylną do góry.</li> 
<li>W dygestorium do hodowli komórkowych należy użyć wycinaka do biopsji o średnicy 2 mm, aby pobrać różne rdzenie z różnych obszarów tkanki, zgodnie z Rysunkiem 1. Rdzenie należy przenieść pęsetą na pokrywkę szalki Petriego o średnicy 15 cm, zachowując odpowiednie odstępy między nimi, aby można było je łatwo przeciąć wzdłuż osi poziomej.</li>
<li>Każdy rdzeń należy podzielić na 4 równe ćwiartki za pomocą wysterylizowanego ostrza żyletki, zgodnie z Rysunkiem 1.</li>
<li>Używając końcówki do pipety, należy umieścić każdą ćwiartkę danego rdzenia w osobnym dołku od A1 do A4, zgodnie z Rysunkiem 1, zawierających już 1,5 ml DMEM z 10% FBS, 1% roztworem penicyliny/streptomycyny i 0,1% roztworem amfoterycyny B. Czynność tę należy powtórzyć dla każdego rdzenia. Pozwoli to na reprezentatywne próbkowanie guza przy jednoczesnym zminimalizowaniu błędu w danym dołku/warunku. Aby uzyskać lepszą reprezentatywność, należy zwiększyć liczbę rdzeni.</li>
</ol>
2. Ocena żywotności tkanek
<ol>
<li>Po obróbce tkanek dodać 25μl Alamar blue do studzienek A1 i A2, zgodnie z rysunkiem 1, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.</li>
<li>Po inkubacji z Alamar blue pobrać trzykrotnie 10 μl z każdej studzienki A1 i A2 i przenieść do 6 różnych studni płyty 96-dołkowej. Odczytać sygnał za pomocą fluorometrycznego czytnika płytek (pobudzenie 530, emisja 590) i zapisać uzyskane dane.</li>
<li>Po odczytaniu sygnału Alamar blue przenieść wszystkie fragmenty tkanki za pomocą końcówki pipety ze studzienki A1 do studzienki C1 zawierającej DMEM, 10% FBS + PS + AmphoB. Należy uważać, aby nie przenieść nadmiernej ilości medium ze studzienki A1.</li>
<li>Zainfekować odpowiednio studzienki A3 i A4 dawką 106 PFU wirusa ospy prawdziwej (vaccinia virus) wykazującego ekspresję GFP oraz lucyferazy, rozcieńczonych w 25 μl medium. Studzienkę A2 można zainfekować wirusem wykazującym ekspresję dowolnego transgenu lub wirusem bez transgenu.</li>
<li>Po 72 godzinach dodać 25 μl Alamar blue do studni C1 i D1 i powtórzyć krok 2.2</li>
</ol>
3. Wizualizacja ekspresji transgenu GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
<li>Usunąć wszystkie pożywki do hodowli komórkowej pokrywające fragmenty tkanki, aby uzyskać wysokiej jakości zdjęcia fluorescencyjne.</li> 
<li>Używając mikroskopu sekcyjnego z możliwością obrazowania fluorescencyjnego, wykonać najpierw zdjęcie w kontraście fazowym z odpowiednią rozdzielczością.</li>
<li>Przełączyć urządzenie w tryb fluorescencji i wykonać zdjęcie przy użyciu odpowiedniego filtra w celu wizualizacji interesującego transgenu, w tym przypadku GFP.</li>
<li>Użyć filtra fluorescencyjnego dla innej długości fali, jak najdalej oddalonej od długości fali interesującego transgenu (np. RFP), aby wykonać zdjęcie fluorescencji tła.</li>
</ol>
4. Wizualizacja ekspresji lucyferazy przy użyciu systemu obrazowania In Vivo (IVIS)
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem upewnij się, że system IVIS został zainicjowany.</li> 
<li>Do studni A4 i B4 dodaj 5 μl podłoża lucyferyny 10 mg/ml, wymieszaj dokładnie i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li> 
<li>Ustaw czas ekspozycji systemu IVIS na 5 sekund i wykonaj zdjęcie studni. Jeśli obraz jest nasycony, powtórz pomiar z krótszym czasem ekspozycji. W przypadku braku sygnału zwiększ czas ekspozycji.</li>
<li>Za pomocą oprogramowania do obrazowania IVIS można usunąć tło, wykorzystując sygnał ze studni B4, a następnie zaznaczyć obszar zainteresowania (ROI) w celu ilościowego oznaczenia sygnału luminescencyjnego.</li>
</ol>
5. Ocena miana wirusa za pomocą metody plackowej
<ol>
<li>Przed oznaczeniem miana wirusa tkanki muszą zostać najpierw zhomogenizowane w celu uwolnienia cząsteczek wirusa. Można to zrobić kilka miesięcy później, jeśli zainfekowane próbki tkanek są przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
<li>Zważ próbkę przeznaczoną do homogenizacji za pomocą wagi analitycznej. W tym przypadku użyjemy próbki pobranej z dołka A2.</li>
<li>Umieść tkankę w 5 ml polistyrenowej probówce Falcon z okrągłym dnem i dodaj 1 ml PBS. Zhomogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora tkankowego. W razie potrzeby przechowuj homogenizat w temperaturze -80 °C w celu późniejszego oznaczenia miana wirusa.</li>
<li>Aby oznaczyć miano wirusa ospy krowiej (vaccinia virus), wysiej najpierw 1 milion komórek U2OS na płytkę 6-dołkową i inkubuj przez noc w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2, tak aby następnego dnia osiągnęły one około 95% konfluencji.</li> 
<li>Użyj pożywki bezsurowiczej do wykonania rozcieńczeń seryjnych wirusa, pamiętając o zmianie końcówek po każdym etapie rozcieńczania. Zazwyczaj wykonujemy rozcieńczenia 1:10, przenosząc 10 μl do 90 μl. Liczba wykonanych rozcieńczeń zależy od przewidywanej wydajności wirusa.</li>
<li>Po przygotowaniu rozcieńczeń usuń pożywkę z wysianych komórek U2OS, a następnie dodaj 50 μl rozcieńczonego roztworu wirusa (dla każdego rozcieńczenia), aby zainfekować komórki U2OS. Inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.</li>
<li>W tym czasie podgrzej 2X stężone DMEM zawierające 20% FBS oraz 3% roztwór CMC w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.</li> 
<li>Po 1-godzinnej inkubacji usuń pożywkę z zainfekowanych komórek U2OS. Wymieszaj objętościowo 1:1 3% CMC z 2X DMEM, 20% FBS i użyj 2 ml tej mieszaniny, aby pokryć każdy dołek z zainfekowanymi komórkami U2OS.</li> 
<li>Umieść komórki ponownie w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na kolejne 48 godzin.</li>
<li>Po 48 godzinach dodaj 2 ml utrwalacza z metanolu i kwasu octowego na warstwę CMC w każdym dołku i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut w komorze do hodowli komórek.</li> 
<li>Wylej utrwaloną warstwę i wypłucz pozostałości z dołków za pomocą wody z kranu.</li> 
<li>Przebarw utrwalone komórki U2OS, dodając 2 ml roztworu Coomassie Blue na dołek, i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy niskiej prędkości na wstrząsarce do płytek.</li> 
<li>Usuń barwnik Coomassie z dołków i przemyj płytki wodą z kranu. Pozostaw do wyschnięcia bez przykrywki przez około godzinę.</li>
<li>Powstałe plaki wirusowe można łatwo zaobserwować na rysunku 2C. Na tym etapie płytki można przechowywać w nieskończoność.</li> 
<li>Policz plaki w tym stopniu rozcieńczenia, w którym widocznych jest od 10 do 10 plaków.</li> 
<li>Pomnóż liczbę policzonych plaków przez zastosowane rozcieńczenie, a otrzymany wynik pomnóż przez 2, aby uzyskać miano w PFU/ml. Na przykład, jeśli w dołku z rozcieńczeniem milionkrotnym policzono 25 plaków, miano początkowej, nierozcieńczonej próbki wynosi 25 pomnożone przez 1 milion pomnożone przez 2, czyli 50 milionów PFU/ml. Następnie podziel tę liczbę przez początkowo zmierzoną wagę próbki, aby podać miano w PFU/g.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki: 
Aby dokładnie określić, czy chirurgicznie pobrana próbka tkanki prawidłowej lub nowotworowej jest podatna na zakażenie wirusem, należy w pierwszej kolejności upewnić się, że próbka tkanki jest żywotna. Rys. 1A pokazuje, że żywotność można ocenić za pomocą barwnika metabolicznego (Alamar blue) oraz że zarówno tkanka prawidłowa, jak i nowotworowa mogą pozostać metabolicznie aktywne przez okres co najmniej 72h. Sugeruje to, że tkanki hodowane ex vivo mogą wspierać replikację wirusa. Znaczącą zaletą wirusów onkolitycznych jest możliwość ich modyfikacji w celu ekspresji terapeutycznych lub obrazujących transgenów. Rys. 2D-E pokazuje, że w tkankach zainfekowanych ex vivo można wykryć GFP lub lucyferazę, co dodatkowo potwierdza, że tkanki te są żywotne oraz podatne na zakażenie. Chociaż zwiększona ekspresja transgenu jest zazwyczaj powiązana z replikacją wirusa, nie musi ona oznaczać produktywnego cyklu życiowego wirusa prowadzącego do samowzmocnienia i rozprzestrzeniania się, co uważa się za istotne dla aktywności terapeutycznej. Z tego powodu konieczne jest ustalenie, czy wyprodukowano więcej wirusa niż użyto do początkowego zakażenia tkanki. Rys. 2B pokazuje, że po ilościowym oznaczeniu wirusa za pomocą testu płytek, po 72 godzinach infekcji uzyskano więcej wirusa niż w tkance pobranej bezpośrednio po zakażeniu. Podsumowując, dane te wykazują, że chirurgicznie wycięta tkanka nowotworowa może pozostać żywotna w hodowli komórkowej przez okres co najmniej 72 godzin, w czasie którego możliwa jest replikacja wirusa.
<img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Przebieg przetwarzania próbek tkankowych; schemat rozmieszczenia rdzeni; żywotność komórek, analiza ekspresji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Przegląd protokołu pobierania próbek i sekcjonowania tkanek. Próbkę tkanki opracowuje się poprzez pobranie kilku rdzeni o średnicy 2 mm, które następnie dzieli się na cztery ćwiartki i rozdziela losowo do dołków A1-A4. Kody kolorystyczne wskazują odczynniki użyte w każdym dołku. Szare pola wewnątrz dołków reprezentują każdą ćwiartkę z przedstawionych 6 poszczególnych rdzeni. Tkanka z dołka A1 zostaje przeniesiona do nowego dołka (C1) z pożywką po wstępnym odczycie alamar blue. Drugi odczyt wykonuje się po zakończeniu 72-godzinnej inkubacji z wirusami. Do dołków A4 i B4 dodaje się lucyferynę po 72-godzinnej inkubacji po infekcji.
<img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Wykresy żywotności tkanek i mian wirusa vaccinia; test plackowy; mikroskopia fluorescencyjna; obrazowanie nowotworów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Żywotność i podatność na zakażenie próbek tkanek pacjentów. A) Żywotność tkanki mierzona sygnałem alamar blue w 2. i 72. godzinie po pobraniu. Oś Y przedstawia sygnał alamar blue po korekcie o próbę ślepą. B) Miano wirusa ospy krowiej (vaccinia virus) zebranych próbek tkanek 2 i 72 godziny po zakażeniu w przeliczeniu na gram tkanki. C) Przykład blaszek wirusa vaccinia na komórkach U2OS po barwieniu Coomassie. D) Sygnał luminescencyjny uzyskany z tkanki pacjenta zakażonej VV-lucyferazą, obrazowany za pomocą systemu IVIS. E) Zdjęcia z mikroskopii fluorescencyjnej próbki tkanki pacjenta zainfekowanej VV-GFP.

<ol><li>Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+battle+between+oncolytic+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).</li>
<li>Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FII+study+of+oncolytic+HSV+GM-CSF+in+combination+with+radiotherapy+and+cisplatin+in+untreated+stage+III%2FIV+squamous+cell+cancer+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck.</a> Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).</li>
<li>Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reovirus%3A+Rationale+and+clinical+trial+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Reovirus: Rationale and clinical trial update.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).</li>
<li>Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus%2C+JX-594%2C+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer%3A+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li>
<li>Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+clinical+development+landscape+for+oncolytic+viruses+and+other+cancer+therapeutics%3A+no+shortcuts+on+the+road+to+approval.+Cytokine+Growth+Factor+Rev%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev.</a> 21, 85-89 (2010).</li>
<li>Boeuf, F. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+between+oncolytic+viruses+augments+tumor+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing.</a> Mol Ther. 18, 888-895 (2010).</li>
<li>Silva, N. D. e, Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+trouble+for+tumours%3A+exploiting+the+tumour+microenvironment+to+enhance+anticancer+effect+of+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).</li>
<li>Diallo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
<li>Cooke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumour+genetic+heterogeneity+and+poor+chemoradiotherapy+response+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer.</a> Br J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utility+of+a+Tissue+Slice+Model+System+to+Determine+Breast+Cancer+Infectivity+by+Oncolytic+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses.</a> J Surg Res. , 1-6 (2010).</li>
<li>Hochberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+of+herpes+simplex+virus+type+1+to+non-melanoma+skin+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers.</a> Br J Dermatol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kuip, H. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Jednym z krytycznych kroków w tym protokole jest pozyskanie świeżej próbki tkanki. Jeśli próbka zostanie poddana hodowli komórkowej po długim oczekiwaniu na sali operacyjnej w niewłaściwym medium (np. PBS), może to obniżyć żywotność tkanki i uniemożliwić infekcję. Warto zauważyć, że tkanka prawidłowa jest z natury bardziej podatna na te efekty niż tkanki nowotworowe. Kolejnym istotnym punktem jest liczba rdzeni wykorzystanych do pobrania próbki tkanki oraz jednolitość ich rozmiaru. Niespójność rozmiarów doprowadzi do zmienności między próbkami pacjentów, ponieważ czynniki takie jak hipoksja tkankowa i powierzchnia podatna na infekcję będą wahać się w zależności od wielkości rdzeni i ich ćwiertek. Choć można to częściowo rozwiązać za pomocą tnąrek do tkanek, zaletą zaprezentowanej tutaj metody jest to, że jest ona stosunkowo prosta, mniej podatna na kontaminację i szeroko stosowalna dla różnych typów tkanek, w tym tkanek miękkich lub lepkich, które nie nadają się łatwo do krojenia tnąrką. Co istotne, liczbę rdzeni można zwiększyć, aby uzyskać lepszą reprezentatywność tkanki. Ponadto rdzenie można podzielić na większą liczbę części (np. 5-8), aby umożliwić równoległe przeprowadzenie innych potencjalnych analiz, takich jak ekstrakcja DNA, RNA lub białek. Jednak liczba części, na które można podzielić rdzenie w celu uzyskania powtarzalnych rozmiarów, będzie zależeć od rzeczywistej wielkości rdzeni, którą można modyfikować, stosując trepany o różnych średnicach. Opcjonalnie, jednym ze sposobów pomagających w uzyskaniu powtarzalnych rozmiarów fragmentów tkanki jest wyrównanie długości rdzeni za pomocą linijki przed ich dalszym podziałem na mniejsze części. Protokół można naturalnie modyfikować w celu dostosowania go do innych wirusów; ustalono, że tkanki mogą zachować żywotność i wspierać replikację przez okres do 6 dni. Protokół ten można dodatkowo rozszerzyć o pomiary innych wirusowo ekspresowanych transgenów, w tym cytokin. Po infekcji tkanki mogą zostać również zatopione w parafinie w celu dalszego krojenia i barwienia metodami immunohistochemicznymi, co pozwala na dokładniejszą analizę histologii tkanki i jej związku z infekcją wirusową10-12.

<table><tbody><tr><td>DMEM z wysoką zawartością glukozy</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowe serum bydlęce</td><td>NorthBio Inc.</td><td>NBSF-701</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór amfotrycyny B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>Stosować w stężeniu 0,1%</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Stosować w stężeniu 1%</td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Sól potasowa D-lucyferyny </td><td>Produkty do obrazowania molekularnego</td><td>Sól potasowa D-lucyferyny 1 g</td><td>Resuspender w PBS do stężenia 10 mg/ml i przefiltrować przez filtr 0,22 μm &amp;#x03BC;filtr m</td></tr><tr><td>proszek MEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>#41500018</td><td>Przygotować połowę sugerowanej objętości w celu otrzymania 2X MEM, a następnie przefiltrować przez filtr 0,22 μm. &amp;#x03BC;filtr m przed użyciem</td></tr><tr><td>Karboksymetyloceluloza (CMC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9481</td><td>Przygotować 3% roztwór w wodzie dejonizowanej i poddać autoklawowaniu. Należy pamiętać, że resuspensja proszku może zająć trochę czasu.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>bioczynnik do biopsji 2 mm</td><td>Miltex Inc.</td><td>MX-33-31</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki dwustronne do przygotowań</td><td>Opieka Medyczna Personna</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny do sekcji</td><td>Leica Microsystems</td><td>model M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; system obrazowania (IVIS) </td><td>Caliper Life Sciences</td><td>IVIS&amp;#174; seria 200</td><td></td></tr><tr><td>Rozrywanie tkanek</td><td>Produkty Biospec</td><td>model 985370-395</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo zakażanie żywej tkanki wirusami onkolitycznymi

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Wirusy onkolityczne (OV) to nowoczesne środki terapeutyczne, które selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych i doprowadzają do ich zniszczenia1Obecnie trwa kilka badań klinicznych oceniających skuteczność różnych platform onkolitycznych, w tym onkolitycznych wirusów (OV) HSV, Reowirusa oraz Vaccinia, w leczeniu nowotworów.2-5Kluczową cechą wirusów onkolitycznych jest możliwość ich modyfikacji genetycznej w celu ekspresji reporterowych transgenów, co umożliwia wizualizację infekcji tkanek za pomocą mikroskopii lub obrazowania bioluminescencyjnego.6,7Stanowi to wyjątkową zaletę, ponieważ możliwe jest zakażenie tkanek pobranych od pacjentów ex vivo przed rozpoczęciem terapii w celu ustalenia prawdopodobieństwa powodzenia onkolitycznej wiroterapii8W tym celu kluczowe jest odpowiednie pobranie próbek tkanki, aby zrekompensować jej heterogeniczność oraz ocenić żywotność tkanki, szczególnie przed infekcją.9Ważne jest również monitorowanie replikacji wirusa za pomocą transgenów reporterowych, jeśli są one ekspresowane przez platformę onkolityczną, a także poprzez bezpośrednie mianowanie tkanek po homogenizacji, aby odróżnić infekcję abortywną od produktywnej. Celem niniejszego protokołu jest rozwiązanie tych problemów i opisano w nim: 1. Pobieranie i przygotowanie tkanki nowotworowej do hodowli komórkowej; 2. Ocenę żywotności tkanki z użyciem barwnika metabolicznego alamar blue; 3. Ex vivo zakażenie hodowli tkanek wirusem vaccinia wykazującym ekspresję GFP lub lucyferazy świetlika 4. Detekcja ekspresji transgenu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub przy użyciu an In vivo System obrazowania (IVIS) 5. Ilościowe oznaczanie wirusa za pomocą metody płytek. Ta kompleksowa metoda oferuje szereg zalet, w tym łatwość obróbki tkanek, kompensację heterogeniczności tkanek, kontrolę żywotności tkanek oraz rozróżnienie między infekcją abortywną a rzetelny replikacja wirusów

Wirusy onkolityczne stanowią obiecującą metodę terapeutyczną w leczeniu nowotworów. Zdolność do oceny podatności na zakażenie żywych próbek tkanek pobranych od pacjentów przed rozpoczęciem leczenia jest unikalną zaletą tego podejścia terapeutycznego. Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania tkanek do zakażenia ex vivo wirusem onkolitycznym oraz późniejszą kwantyfikację wirusa.

Ex Vivo zakażanie żywej tkanki wirusami onkolitycznymi

Wirusy onkolityczne (OV) to nowoczesne preparaty terapeutyczne, które selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych i doprowadzają do ich zniszczenia1. Przeprowadzono szereg badań klinicznych oceniających skuteczność ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja replikacji onkolitycznego wirusa ospy krowiej (vaccinia virus) w świeżych tkankach uzyskanych po operacji. Osiąga się to poprzez pobieranie próbek tkanki do hodowli komórkowej, aby zminimalizować błąd wynikający z heterogeniczności tkanki. W drugim kroku oceniana jest żywotność tkanki, co zapewnia jakość materiału wyjściowego przed zakażeniem wirusem.Następnie monitoruje się ekspresję genów trendu wirusowego i określa miana wirusa. Aby ocenić, czy żywa próbka chirurgiczna może wspierać produkcyjną infekcję szczepem vaccinia, uzyskuje się wyniki wykazujące replikację vaccinia w tkankach na podstawie obserwacji ekspresji białka fluorescencyjnego lub reportera bioluminescencyjnego oraz wzrostu miana wirusa w czasie.Witajcie, jestem Jean Simone Diallo. Implikacje tej techniki wykraczają w stronę terapii nowotworów, ponieważ mogą one prowadzić do identyfikacji pacjentów, którzy mogą być odpowiednimi kandydatami do leczenia wirusami onkolitycznymi. Cześć, ja jestem Naomi.Metoda ta pozwala na ocenę zdolności tkanek nowotworowych do zakażenia onkolitycznym wirusem ospy prawdziwej. Można ją również zastosować do innych wirusów onkolitycznych, takich jak wirus zapalenia jamy gębowej pęcherzykowego, a prawdopodobnie po niewielkich modyfikacjach także do wirusa opryszczki prostego, adenowirusa oraz wirusa Rio. Cześć, jestem Dominic.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ pobieranie rdzeni z tkanek w sposób powtarzalny może być problematyczne, a pocięcie tych rdzeni na małe i równe fragmenty może stanowić wyzwanie. Witajcie, jestem John Bell. Dzisiejszą procedurę zaprezentują dwoje zdolnych doktorantów z mojego laboratorium, Naomi DeSilva i Dominic Wa. Pomagać im będzie Derek Butterwick, rezydent chirurgii z Ottawa Hospital. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy użyć wycinaka do biopsji o średnicy 2 mm, aby pobrać rdzenie tkankowe z różnych obszarów próbki tkanki.Każdy rdzeń tkanki przenieś pipetą do pokrywki odwróconej szalki Petriego zawierającej PBS, używając pęsety do ewentualnej korekty ułożenia próbki. Zachowaj odpowiednie odstępy między rdzeniami, aby umożliwić ich łatwe cięcie wzdłuż osi poziomej. Używając wysterylizowanego ostrza żyletki, podziel każdy rdzeń tkanki na cztery równe ćwiartki.Następnie za pomocą końcówki pipety umieść każdą ćwiartkę w czterech oddzielnych dołkach płytki 24-dołkowej zawierającej dwa mililitry pożywki. Powtórz tę czynność dla każdej ćwiartki drugiego rdzenia, umieszczając te ćwiartki w tych samych czterech dołkach płytki 24-dołkowej. Kontynuuj w ten sposób, aż wszystkie rdzenie tkankowe zostaną naniesione na płytki.Po umieszczeniu wszystkich rdzeni próbek tkankowych w dołkach, należy dodać 25 µL alamar blue do jednego z dołków zawierających tkankę oraz do dołka kontrolnego, a następnie inkubować przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37°C w inkubatorze nawilżanym z 5% carbon dioxide. Po upływie czasu inkubacji należy pobrać trzy alikwoty po 100 µL z każdego dołka potraktowanego alamar blue i przenieść je do osobnych dołków płytki 96-dołkowej. Czynność tę należy powtórzyć dla dwóch kolejnych alikwotów po 100 µL z tych samych dołków.Odczytaj sygnał alamar blue za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek i zapisz dane. Używając końcówki do pipety, przenieś każdy fragment tkanki z dołków traktowanych alamar blue do dołków płyty 24-dołkowej zawierających czyste medium. Unikaj przenoszenia dużych ilości medium wraz z próbką.Następnie jedną z dolek zawierających tkankę zakażamy sześcioma jednostkami tworzącymi plakę wirusa vaccinia wykazującego ekspresję GFP, rozcieńczonymi w 25 µL medium. Następnie inną dolkę zakażamy sześcioma jednostkami tworzącymi plakę wirusa vaccinia wykazującego ekspresję lucyferazy. Płytkę inkubujemy w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2 przez 72 godziny po zakażeniu.Do wcześniej analizowanej próbki dodać 25 µL alamar blue. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżeniem i 5% carbon dioxide. Następnie pobrać trzy próbki po 100 µL i przeanalizować w fluorescencyjnym czytniku płytek w sposób opisany wcześniej.Najpierw odessać pożywkę z dołka traktowanego wirusem vaccinia wykazującym ekspresję GFP, a następnie dwukrotnie przemyć go PBS bezpośrednio w dołku. Następnie, używając mikroskopu sekcyjnego z możliwością detekcji fluorescencji, wykonać obraz w kontraście fazowym fragmentu tkanki przy odpowiednim powiększeniu 40x.Następnie przełącz urządzenie w tryb fluorescencji i użyj filtra odpowiedniego dla GFP. Zwizualizuj ekspresję GFP w tkance transdukowanej GFP. Na koniec użyj filtra fluorescencyjnego dla innej długości fali, jak najdalej oddalonej od długości fali badanego transgenu.Następnie wykonaj zdjęcie fluorescencji tła. Potem zbierz fragmenty tkanki za pomocą końcówek do pipet. Zważ tkankę.Pomiar ten zostanie wykorzystany do obliczenia miana wirusa w jednostkach tworzących w przeliczeniu na gram na koniec procedury. Próbki tkanki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego oznaczania miana. Do dołka, w którym przeprowadzono transdukcję wirusem vaccinia wykazującym ekspresję lucyferazy, oraz do dołka zawierającego wyłącznie pożywkę do hodowli tkankowej należy pipetować 5 µL substratu lucyferazy o stężeniu 10 mg/mL. Następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.Włóż płytkę do systemu obrazowania in vivo i ustaw czas ekspozycji na pięć sekund. Wykonaj zdjęcie studzienek transdukowanych wirusem vaccinia wykazującym ekspresję lucyferazy. Powtórz procedurę z krótszym czasem ekspozycji, jeśli obraz wydaje się nasycony, lub zastosuj dłuższy czas ekspozycji, jeśli nie zaobserwowano sygnału.Przygotować płytkę sześciodołkową zawierającą 1 milion żywych komórek U2 OS na dół w pełnym medium i inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aby następnego dnia studnie osiągnęły 95% konfluencji. Pobrać wcześniej zważone próbki zainfekowanej tkanki. Przenieść próbki do 5 ml polistyrenowej probówki wirówkowej z zaokrąglonym dnem i dodać 1 ml PBS.Użyj homogenizatora tkanek, aby zhomogenizować tkankę i uwolnić cząsteczki wirusa. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia zawiesiny wirusowej z homogenatu tkanki w stosunku 1:10 w pożywce bezsurowiczej, przenosząc 100 µL zawiesiny wirusowej z homogenatu tkanki do 900 µL pożywki bezsurowiczej i powtarzając tę czynność w razie potrzeby. Następnie odessij pożywkę z płytki sześciodołkowej zawierającej komórki U2 OS.Pipetuj 500 µL każdego rozcieńczenia seryjnego do dołka płytki. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych na jedną godzinę, delikatnie kołysząc płytkami co 15 minut, aby zapobiec wysychaniu komórek podczas inkubacji. Podgrzej butelkę z 2x DMEM zawierającym 20% FBS oraz alikwot roztworu 3% CMC w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po ogrzaniu przygotuj mieszaninę 3% CMC oraz 2x DMEM z 20% FBS w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać końcowe stężenie 1,5% CMC i 10% FBS.Po inkubacji odessać pożywkę z komórek U2 OS i zastąpić ją dwiema mililitrami mieszaniny 1,5% CMC 10% F-B-S-D-M-E-M na każdą studnię, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych na kolejne 48 godzin. Po 48 godzinach dodać do mieszaniny pożywki z CMC w każdej studni dwa mililitry utrwalacza z metanolu i kwasu octowego, a następnie inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze do hodowli tkankowych.Po upływie czasu inkubacji odessać roztwór z każdej dołki. Każdą dołkę dokładnie wypłukać wodą z kranu, aby usunąć pozostałości utrwalacza. Następnie do każdej dołki pipetować dwa mililitry roztworu kumasi blue.Następnie umieść płytkę na platformie wytrząsowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wytrząsając z niską prędkością; odessaj roztwór błękitu kumasi z dołków i wypłucz je wodą z kranu. Pozostaw nieprzykrytą płytkę w dygestorium do wyschnięcia na około godzinę. Policz plaki wirusowe w stopniu rozcieńczenia, w którym widocznych jest od 10 do 100 plaków.Pomnożoną liczbę policzonych plam przez użyte rozcieńczenie należy następnie pomnożyć przez dwa, aby uzyskać miano w jednostkach tworzących plamy na mililitr. Następnie liczbę tę należy podzielić przez początkową masę próbki, aby określić wynik w jednostkach tworzących plamy na gram. Wykres ten ilustruje żywotność tkanki mierzoną intensywnością sygnału alma blue po dwóch i 72 godzinach od pobrania i pokazuje, że zarówno tkanka prawidłowa, jak i nowotworowa mogą pozostać metabolicznie aktywne przez okres co najmniej 72 godzin.Te reprezentatywne dane pokazują większą ilość wirusa ospy prawdziwej (vaccinia virus) zebraną na gram próbki tkanki w drugiej i 72. godzinie po zakażeniu. Wskazuje to, że wirus przechodzi przez produktywny cykl życiowy, który prowadzi do samopowielania i rozprzestrzeniania się. Obraz ten ilustruje typowy sygnał luminescencji otrzymany z wirusa ospy prawdziwej pacjenta.Próbki tkanek zainfekowanych lucyferazą obrazowane za pomocą systemu obrazowania in vivo. Obszary intensywnej luminescencji są zaznaczone kolorem czerwonym zgodnie z paskiem skali luminescencji po prawej stronie; porównanie obrazów mikroskopii w kontraście fazowym oraz w kanale fluorescencji GFP pokazuje proporcję tkanki transdukowanej wirusem ospy prawdziwej GFP. Brak sygnału w kanale czerwonym wskazuje na specyficzność sygnału fluorescencyjnego.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o użyciu świeżej tkanki i w miarę możliwości pobieraniu próbek z obszarów reprezentatywnych. Zamiast miareczkowania można zastosować inne metody, takie jak utrwalanie tkanek, immunohistochemia oraz ekstrakcja DNA lub RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład: jakie konkretne struktury tkankowe są zakażane przez wirusa i jaki jest wpływ wirusa na ekspresję genów? Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przetwarzamy próbki do infekcji ex vivo wirusem vaccinia oraz w jaki sposób śledzimy rozprzestrzenianie się wirusa poprzez ekspresję transgenów GFP lub lucyferazy.I na koniec, sposób, w jaki zagęszczamy wirusa z próbek procesu. Należy pamiętać, że praca z żywymi wirusami może być niebezpieczna w zależności od szczepu, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i praca w odpowiednim dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.

ex-vivo-infection-of-live-tissue-with-oncolytic-viruses

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ex Vivo Zakażenie żywych tkanek wirusami onkolitycznymi

Niniejszy artykuł opisuje hodowlę przekrojów tkanek pacjenta do badań nad dostarczaniem genów oraz późniejszą analizę ekspresji genów z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Ex Vivo hodowla tkanki pacjenta i badanie dostarczania genów

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Uznane linie komórek rakowych i ksenoprzeszczepy były podstawą badań nad rakiem przez ostatnie kilkadziesiąt lat. Jednak najnowsze dowody sugerują, że na odpowiedź terapeutyczną duży wpływ ma mikrośrodowisko komórek nowotworowych. W związku z tym opracowaliśmy analizę ex vivo pierwotnych próbek guzów w celu opracowania leków.

Ex vivo Odpowiedź na leczenie guzów pierwotnych i/lub związanych z nimi przerzutów w przedklinicznym i klinicznym rozwoju terapii

Szczury bawełniane są niezwykle pobudliwe i mają silną reakcję ucieczki lub walki. Opisano metodę postępowania zoptymalizowaną w celu zmniejszenia stresu u zwierząt, która sprawi, że szczury bawełniane będą bardziej dostępne jako model przedkliniczny.

Postępowanie ze szczurem bawełnianym w badaniach nad oceną przedkliniczną wirusów onkolitycznych

Wirusoterapie onkolityczne są w trakcie opracowywania jako nowe terapie w leczeniu raka wątrobowokomórkowego (HCC).  W tym artykule opisano metodę lokoregionalnej terapii HCC poprzez wątrobowe podawanie wirusa onkolitycznego do tętnic.

Przeztętnicze podawanie wirusów onkolitycznych w lokoregionalnej terapii ortotopowego HCC u szczurów

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Zakażenie tkanek ludzkich ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) ex vivo dostarcza cennego modelu 3D patogenezy wirusa. W tym miejscu opisujemy protokół przetwarzania i infekowania próbek tkanek z ludzkich migdałków i błon śluzowych żeńskich narządów płciowych wirusem HIV-1 i utrzymywania ich w kulturze na granicy faz ciecz-powietrze.

Ex vivo Zakażenie ludzkiej tkanki limfatycznej i błony śluzowej żeńskich narządów płciowych ludzkim wirusem niedoboru odporności 1 i histokultura

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Poznaj metodę zakażenia świeżych tkanek chirurgicznych wirusem onkolitycznym vaccinia, oceny ich żywotności oraz monitorowania replikacji wirusowej. Protokół ten pomaga identyfikować pacjentów, którzy mogą odpowiedzieć na terapię wirusową.

Ex Vivo zakażanie żywej tkanki wirusami onkolitycznymi

Przeglądaj więcej filmów