Name: Konkurencyjne badania genomowe bibliotek drożdży z kodami kreskowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Poznaj metody badania interakcji gen-lek w drożdżach Candida albicans przy użyciu bibliotek z kodami kreskowymi. Technika ta umożliwia równoległą analizę tysięcy mutantów w skali genomowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ronowi Davisowi, Adamowi Deutschbauerowi oraz całemu zespołowi laboratorium HIP HOP na Uniwersytecie w Toronto za dyskusje i porady. C.N. jest wspierany przez granty z National Human Genome Research Institute (numer grantu HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305 oraz Canadian Cancer Society (#020380). J.O. otrzymał wsparcie w ramach Stanford Genome Training Program (numer grantu T32 HG00044 z National Human Genome Research Institute) oraz National Institutes of Health (numer grantu P01 GH000205). GG jest wspierany przez NHGRI RO1 HG003317 i Canadian Cancer Society, grant nr 020380, TD oraz Donnelly Sequencing Centre, które jest częściowo wspierane przez granty Canadian Foundation for Innovation przyznane dr Brenda Andrews i dr Jackowi Greenblattowi. A.M.S. jest wspierany przez stypendium University of Toronto Open Fellowship.

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy przedstawiliśmy protokół, który po niewielkich modyfikacjach można łatwo dostosować do szerokiego zakresu istniejących kolekcji mutantów z kodami kreskowymi różnych mikroorganizmów w celu stworzenia oznakowanych kolekcji mutantów. Podkreślamy, że choć opisaliśmy protokół oznakowanej mutagenezy transposonowej dla patogennego drożdżaka C. albicans, bardzo podobny protokół można dostosować do wielu rodzajów grzybów jednokomórkowych. Po zmodyfikowaniu protokół ten dobrze działa u bakterii 13, a obecnie w przygotowaniu są kolekcje dla szeregu dodatkowych genomów grzybowych i bakteryjnych. Obecnie badanie to stanowi jedyny kompleksowy, bezstronny screening w skali całego genomu pod kątem interakcji gen-mała cząsteczka. Szczególnie przekonującą cechą tego badania jest to, że nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat genu lub małej cząsteczki. Mimo zakresu i mocy tych analiz, ich przenoszalność do innych laboratoriów była w pewnym stopniu utrudniona przez początkowe nakłady kapitałowe oraz narzędzia informatyczne do analizy wyników. Przewidujemy, że wraz z wprowadzeniem odczytu sekwencjonowania nowej generacji w połączeniu z solidnymi narzędziami analitycznymi, ich zastosowanie wzrośnie.

konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Dzięki postępom w technologiach sekwencjonowania następnej generacji niemal codziennie otrzymujemy dostęp do nowych sekwencji genomowych. Tempo tych postępów przyspiesza, obiecując większą głębokość i szerokość analiz. W świetle tych nadzwyczajnych osiągnięć coraz ważniejsza staje się potrzeba opracowania szybkich, równoległych metod definiowania funkcji genów. Kolekcje mutantów z delecjami w całym genomie drożdży oraz E. coli służyły jako podstawowe narzędzia do funkcjonalnej charakterystyki genów, jednak podejście to nie jest skalowalne, ponieważ obecne metody delecji wymagają usunięcia i weryfikacji każdego z tysięcy genów tworzących genom. Dopiero po zakończeniu tych prac można przystąpić do wysokoprzepustowego fenotypowania. W ciągu ostatniej dekady nasze laboratorium udoskonaliło zestaw konkurencyjnych, zminiaturyzowanych, wysokoprzepustowych testów genomowych, które można przeprowadzać równolegle. Ta paralelizacja jest możliwa dzięki wprowadzeniu „tagów” DNA, czyli „kodów kreskowych” (barcodes), do każdego mutanta, gdzie kod kreskowy służy jako wskaźnik mutacji, a pomiar jego liczności pozwala ocenić kondycję (fitness) mutanta. W niniejszym badaniu dążymy do wypełnienia luki między sekwencją DNA a kolekcjami mutantów z kodami kreskowymi. Aby to osiągnąć, wprowadzamy połączoną metodę zakłócania przez transpozony i kodowania kreskowego, która umożliwia przeprowadzanie równoległych testów z kodami kreskowymi dla nowo zsekwencjonowanych, lecz słabo scharakteryzowanych drobnoustrojów. Aby zilustrować to podejście, prezentujemy nową kolekcję zakłóceń z kodami kreskowymi dla Candida albicans i opisujemy, w jaki sposób platformy oparte na mikromacierzach oraz sekwencjonowaniu następnej generacji mogą być wykorzystane do zebrania od 10 000 do 1 000 000 interakcji gen-gen i lek-gen w ramach jednego eksperymentu.

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Dzięki postępom w technologiach sekwencjonowania nowej generacji niemal każdego dnia zyskujemy dostęp do nowych sekwencji genomów. Tempo tych postępów jest...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie zakodowanych paskodami w całej skali genomu kolekcji drobnoustrojów do zrozumienia interakcji gen-lek oraz gen-środowisko w sposób wysoce równoległy. Osiąga się to poprzez przesiewanie kolekcji drobnoustrojów przez od pięciu do 20 pokoleń wzrostu w obecności leku, z wykorzystaniem robotyki w celu utrzymania komórek w fazie wzrostu wykładniczego. W drugim kroku pobierane są komórki, co pozwala na jednoczesną ekstrakcję genomowego DNA z 4 000 do 6 000 osobników.Następnie produkty PCR zawierające namnożone kody kreskowe są kwantyfikowane za pomocą hybrydyzacji na mikromacierzach lub sekwencjonowania kodów kreskowych w celu ich ilościowego oznaczenia, a tym samym określenia liczebności każdego szczepu w złożonej puli. W rezultacie uzyskuje się dane wskazujące, które z mutantów z kodem kreskowym są wrażliwe na zastosowane zabiegi i w związku z tym ulegają usunięciu z puli w trakcie eksperymentu. Główną zaletą techniki, którą dziś zaprezentujemy, jest fakt, że zamiast pracować z poszczególnymi szczepami jako koloniami na płytkach lub w oddzielnych kulturach płynnych, możemy pobrać dziesiątki lub setki tysięcy różnych szczepów i analizować je jako jedną wspólną pulę.Kiedy uświadomiliśmy sobie potencjał tego testu, musieliśmy go zautomatyzować. Na szczęście pracowałam wówczas w Stanford Genome Technology Center w otoczeniu inżynierów, dzięki którym udało mi się to osiągnąć. Dzisiejszy protokół zaprezentuje Andrew Smith, starszy doktorant w moim laboratorium, który omówi wszystkie procedury i powiązane z nimi etapy, a także Tanya Durick, która pokaże nam, jak przeprowadzić sekwencjonowanie w ramach tego protokołu. Protokół ten wykorzystuje bibliotekę mutantów Candida albicans wytworzonych poprzez mutagenezę transpozonową, w której każdy mutant posiada tag kodowy, co pozwala na łączenie poszczególnych mutantów w jedną pulę. Kopia biblioteki została przeniesiona na płyty 384-dołkowe.Płytki z pożywką zawierające kolonie należy inkubować w temperaturze 30°C przez dwa do trzech dni, aż osiągną maksymalny rozmiar. Następnie, pracując w warunkach mikrobiologicznych przy użyciu palnika i sterylnych naczyń laboratoryjnych, należy zalać każdą płytkę od 5 do 10 ml pożywki i pozostawić na pięć minut. Kolonie należy resuspendować za pomocą rozściełacza komórek, a następnie przelać ciecz wraz z komórkami do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.Dodaj DMSO do stężenia 7%. Doprowadź komórki do końcowej gęstości optycznej OD 600 wynoszącej 50 na mililitr w pożywce zawierającej 7% DMSO, a następnie rozdziel do probówek paskowych PCR w objętościach 40 µL; połączone aliquoty komórek można przechowywać w czasie nieokreślonym w temperaturze -80 °C. Aby rozpocząć procedurę, rozmroź połączone aliquoty komórek na lodzie, a następnie ostrożnie rozcieńcz zawiesinę w pożywce z wybranym lekiem lub w odpowiednich warunkach, szczepiąc je przy OD 600 wynoszącej 0,0625 w całkowitej objętości 700 µL na dołek w płytce 48-dołkowej. Na potrzeby tego filmu zostaną przygotowane powtórzenia trzykrotne dla dwóch warunków.Należy uwzględnić na płytce co najmniej jedną odpowiednią kontrolę rozpuszczalnika. Płytkę należy uszczelnić plastikową folią uszczelniającą, a komórki hodować w spektrofotometrze lub w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 30 °C, stosując eksperymentalnie ustalony reżim wytrząsania. Na przykład: wytrząsanie przez 14 minut, odczyt z dołków przez jedną minutę, a następnie wznowienie wytrząsania.Część zawiesiny komórkowej może zostać pobrana przez robota i zapisana na płytce w sekcji robotycznej. Pobieranie odbywa się w określonych przez użytkownika punktach czasowych generacji, zazwyczaj po 5, 10, 15 i 20 generacjach wzrostu. Należy pobrać komórki o wartości od 600 wynoszącej co najmniej dwa dla każdej próbki i punktu czasowego.Przenieś zebrane próbki komórek do probówek do mikrowirówki z bezpiecznym zamknięciem (safe-lock). Komórki te mogą zostać następnie wykorzystane do ekstrakcji genomicznego DNA, co zostanie pokazane w kolejnym kroku w celu rozpoczęcia tej procedury. Oczyszczone genomiczne DNA z komórek zebranych w różnych punktach czasowych przy użyciu zestawu yeast star kit.Zgodnie z instrukcjami producenta, z jedną modyfikacją, eluuj DNA przy użyciu 300 µL 0.1 XTE. Następnie przygotuj dwie reakcje PCR dla każdej próbki: jedną dla tagów UPT oraz jedną dla tagów down.Sprawdź uzyskane produkty PCR na żelu. W przypadku amplikonów wykorzystywanych do hybrydyzacji, jak pokazano w ścieżkach pierwszej i trzeciej, oczekiwany jest produkt o długości 60 par zasad dla obu reakcji PCR. W tym przykładzie dla amplikonów do sekwencjonowania kodów kreskowych oczekiwany jest produkt o długości 130 par zasad, co pokazano w ścieżkach piątej i siódmej.Na tym etapie produkty PCR można wykorzystać do analizy mikroarray lub bezpośredniego sekwencjonowania kodów kreskowych, w zależności od tego, który produkt PCR został uzyskany. Aby przygotować analizę mikroarray, należy wstępnie rozgrzać piec do hybrydyzacji do 42 °C oraz przygotować łaźnię wodną z wrzącą wodą oraz wiaderko z lodem zawierające mieszaninę lodu i wody. Płytki mikroarray należy wstępnie zwilżyć, powoli wypełniając je 120 µL jednokrotnego buforu do hybrydyzacji (1x hybridization Buffer).Inkubuj macierze w buforze do hybrydyzacji w temperaturze 42°C przy 20 RPM przez 10 minut. Podczas inkubacji macierzy przygotuj probówki typu lock top o pojemności 0,5 ml, wlewając do każdej 120 µL buforu do hybrydyzacji. Przygotuj jedną probówkę na każdą próbkę oraz jedną dodatkową jako bufor. Do mieszaniny do hybrydyzacji dodaj 30 µL produktu PCR z tagiem „uptake” oraz 30 µL produktu PCR z tagiem „down”, aby uzyskać całkowitą objętość 150 µL.Gotować przez dwie minuty, a następnie umieścić w wodzie z lodem na co najmniej dwie minuty. Przed użyciem krótko odwirować probówki. Usunąć bufor przedhybrydyzacyjny z matryc i dodać 120 µL mieszaniny PCR do hybrydyzacji, aby zapobiec odparowaniu.Przykryj uszczelki macierzy ToughSpotem, a następnie przeprowadź hybrydyzację przez 16 godzin w temperaturze 42 °C przy 20 RPM. Wyjmij macierze z pieca do hybrydyzacji i usuń ToughSpoty z chipów. Powoli odessaj mieszaninę hybrydyzacyjną z macierzy za pomocą pipety, a następnie napełnij macierze.Za pomocą 120 µL buforu do płukania A załaduj macierze do myjki przygotowanej stacji płynowej. Macierze zostaną poddane płukaniu zgodnie z protokołem gene Flex SV 3 4 50 z następującymi modyfikacjami: dodano jeden dodatkowy etap płukania buforem A przed barwieniem.Płukanie B w temperaturze 42°C zamiast 40°C oraz barwienie w temperaturze 42°C na stacji płynowej zamiast w 25°C. Po operacjach płynowych uruchom stację płynową, a następnie zakończ protokół four 50. Rozładuj myjkę po upewnieniu się, że nie ma pęcherzyków powietrza.Umieść tablice w skanerze i wykonaj skanowanie przy długości fali emisji 560 nanometrów. Produkt PCR o długości 130 par zasad jest wykorzystywany do sekwencjonowania kodów kreskowych następnej generacji (next generation barcode sequencing); aby to osiągnąć, najpierw rozdziel 12 próbek DNA w pulach na żelu 12%. Następnie zabarw żel barwnikiem cyber green i wytnij interesujący pas żelowy.Następnie ilość DNA wyekstrahowanego z żelu określa się za pomocą real-time PCR, a następnie generuje klastry na pojedynczej komórce przepływowej do odczytu (flow cell), używając CBOT oraz zestawu do generowania klastrów pojedynczego odczytu. Wprowadź komórkę przepływową do sekwenatora i obserwuj odczyt pierwszej zasady. Przedstawiony tutaj sekwenator jest reprezentatywny dla danych zebranych w określonych punktach protokołu.Pulę znakowanych mutantów hodowano przez 20 pokoleń w obecności środka przeciwgrzybiczego klotrimazolu oraz w DMSO jako kontroli; dla każdego genu obliczono i wykreślono stosunek log2. Wszystkie szczepy wykazujące istotną wrażliwość na działanie klotrimazolu z wartością stosunku log2 równą 2 zaznaczono kolorem czerwonym. W tym przykładzie pokazano cztery szczepy: NCP1, ERG2 oraz dwa niezależne allele ERG11.Podatność szczepów, które w badaniu przesiewowym z próbkami łączonymi zostały zidentyfikowane jako wrażliwe na klotrimazol – lek przeciwgrzybiczy o znanym białkowym celu molekularnym – powinna zostać zweryfikowana w indywidualnych testach wzrostu w obecności tej samej stężenia leku. Następny wykres przedstawia wyniki takiego eksperymentu potwierdzającego. Cztery szczepy wykryte w badaniu przesiewowym wykazały zmniejszony wzrost w porównaniu ze szczepem rodzicielskim typu dzikiego.BWP 17 zaznaczono kolorem czarnym. Te indywidualne krzywe wzrostu podkreślają istotną cechę takich pulowych przesiewów genetycznych leków, polegającą na tym, że absolutny ranking konkretnego szczepu niekoniecznie odzwierciedla jego dokładny poziom wrażliwości. Co więcej, wyniki wykazują wartość posiadania wielu alleli dla każdego genu.W tym przypadku dwa mutanty z zaburzeniem genu ERG 11 wykazują nieco różną wrażliwość na lek. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, cały proces – od inokulacji przesiewu po analizę danych – może zostać zrealizowany w ciągu pięciu dni. Zatem choć każdy pojedynczy eksperyment dostarcza cennych informacji biologicznych, prawdziwy potencjał ujawnia się po przeprowadzeniu wielu badań i zgromadzeniu bazy danych, która pozwala na przewidywanie funkcji genów oraz działania leków.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania barcodedowych kolekcji mutantów w skali całego genomu do przesiewania w pulach, a także sposobów wykorzystania mikromacierzy lub sekwencjonowania do identyfikacji interesujących genów po przeprowadzeniu analizy. Technika ta umożliwiła badaczom w dziedzinie genomiki funkcjonalnej zbadanie funkcji każdego z 6 000 różnych genów w genomie drożdży.

competitive-genomic-screens-of-barcoded-yeast-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Konkurencyjne badania genomowe kodowanych bibliotek drożdży

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Ilościowa Analiza Przystosowania (QFA) to komplementarna seria metod eksperymentalnych i obliczeniowych służąca do szacowania przystosowania kultur mikrobiologicznych. QFA pozwala ocenić wpływ mutacji genetycznych, leków lub innych zastosowanych zabiegów na wzrost drobnoustrojów. Możliwe jest zaprojektowanie eksperymentów o skali od ukierunkowanej analizy pojedynczych kultur po tysiące kultur prowadzonych równolegle.

Schemat ilościowej analizy sprawności fizycznej

NAJLEPSZE: Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży wybranych do pozytywnych interakcji drożdży z hybrydami 2 potencjalnie dostarcza wielu informacji na temat oddziałujących białek partnerskich. W tym miejscu opisujemy działanie konkretnych narzędzi bioinformatycznych i dostosowanego zaktualizowanego oprogramowania do analizy danych sekwencyjnych z takich ekranów.

Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Poznaj metody badania interakcji gen-lek w drożdżach Candida albicans przy użyciu bibliotek z kodami kreskowymi. Technika ta umożliwia równoległą analizę tysięcy mutantów w skali genomowej.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Przeglądaj więcej filmów