Name: Wykorzystanie ludzkich okołonaczyniowych komórek macierzystych do regeneracji kości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj izolację okołonaczyniowych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i ich zastosowanie w regeneracji kości. Metoda obejmuje hodowlę z rusztowaniami oraz modele zwierzęce w celu oceny osteogenezy in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez CIRM Early Translational II Research Award TR2-01821, NIH/NIDCR (granty R21 DE0177711 oraz RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10677; AWJ i RKS otrzymali stypendia szkoleniowe T32 (5T32DE007296-14), a JNZ otrzymał stypendium szkoleniowe CIRM (TG2-01169).

1. Izolacja komórek macierzystych okołonaczyniowych
Zostało to szczegółowo opisane w towarzyszącym artykule „Purification of Perivascular Stem Cells from Human White Adipose tissue” autorstwa M. Corselli et al.
2. Tworzenie rusztowania
<ol>
	<li>Rusztowania są wykonywane na zamówienie zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA, Burmingham Polymer) z powłoką z hydroksyapatytu4-6. Rusztowania PLGA powlekane apatytem są wytwarzane z PLGA 85/15 metodą odlewania z rozpuszczalnikiem i wymywania cząsteczek. Rusztowania są tworzone w kształcie sferycznym (średnica 2 mm) do implantacji w woreczku mięśniowym, w kształcie dyskowym (średnica 4 mm) do implantacji w czaszce lub cylindrycznym (średnica 4 mm, długość 6 mm) do ubytków segmentowych kości udowej.</li>
	<li>Krótko mówiąc, roztwory PLGA/chloroform zmieszane z sacharozą (stosunek polimer/sacharoza 5/95, w/w) są odlewane do teflonowej formy o średnicy 200-300 μm w celu stworzenia spersonalizowanej konstrukcji. Po liofilizacji przez noc rusztowania są usuwane z formy teflonowej i zanurzane w ddH2O w celu rozpuszczenia sacharozy. Rusztowania są dezynfekowane poprzez zanurzenie w 70% etanolu przez 30 min, a następnie trzykrotnie płukane w ddH2O.</li>
	<li>W celu nałożenia powłoki apatytowej przygotowuje się roztwór symulowanego płynu ustrojowego (SBF) poprzez sekwencyjne rozpuszczanie CaCl2, MgCl2•6H2O, NaHCO3 i K2HPO4•3H2O w ddH2O. pH roztworu jest obniżane do 6 poprzez dodanie 1M kwasu solnego w celu zwiększenia rozpuszczalności. Dodaje się Na2SO4, KCl oraz NaCl, a końcowe pH jest dostrajane do 6,5 (SBF 1).</li>
	<li>SBF wolny od Mg2+ i HCO3- (SBF 2) przygotowuje się poprzez dodanie CaCl2 i K2HPO4•3H2O do ddH2O, a pH jest obniżane do 6. Dodaje się KCl i NaCl, a końcowe pH jest dostrajane do 6,8. Wszystkie roztwory są filtrowane sterylnie przez membranę PES 0,22 μm (Nalgene). Bezpośrednio przed procesem powlekania wysuszone rusztowania PLGA są poddawane trawieniu plazmą argonową w wyładowaniu żarowym (Harrick Scientific) w celu poprawy zwilżalności i jednorodności powłoki.</li>
	<li>Wytrawione rusztowania są następnie inkubowane w SBF 1 przez 12 h, a następnie przenoszone do SBF 2 wolnego od Mg2+ i HCO3- na kolejne 12 h w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu. Powlekane rusztowania są płukane w ddH2O w celu usunięcia nadmiaru jonów i liofilizowane przed dalszymi badaniami.</li>
</ol>
3. Implantacja w modelu kieszonki mięśniowej
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed implantacją 100 μl zawiesiny PSC w PBS (soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) delikatnie nanosi się na sferyczny implant na bazie PLGA. Komórki zostały wcześniej oznakowane poprzez lentiwirusową insercję lucyferazy świetlika, aby umożliwić śledzenie in vivo po implantacji. Gęstość komórek wynosi 2,5 x 105 na implant.</li>
	<li>Do badania wykorzystuje się 6-tygodniowe myszy SCID (z ciężkim złożonym niedoborem odporności). Zwierzęta poddaje się znieczuleniu poprzez inhalację izofluranem i premedykację buprenorfiną (Bedford Labs). Po standardowym przygotowaniu pola Betadyną wykonuje się obustronne nacięcia w kończynach tylnych (podłużne, o długości 2 mm).</li>
	<li>W mięśniach dwugłowych uda, równolegle do długiej osi włókien mięśniowych, wykonuje się kieszonki metodą tępej dyssekcji. W każdej myszy umieszcza się implant na bazie PLGA z PSC, a powłokę nad mięśniem zszywa się nicią 5-0 Vicryl (Ethicon).</li>
	<li>Następnie skórę zamyka się nicią 5-0 Vicryl szwem podskórnym. Po operacji zwierzęta otrzymują buprenorfinę przez 48 godzin oraz TMP/SMX (trimetoprim/sulfametoksazol; Qualitest) przez 10 dni.</li>
</ol>
4. Implantacja w modelu defektu sklepienia czaszki
<ol>
	<li>Po znieczuleniu myszy SCID (w wieku 12-14 tygodni) izofluranem, sierść zostaje przystrzyżona, a skóra zdezynfekowana betadyną zgodnie z protokołem.</li>
	<li>Wzdłuż szwu pośrodkowego strzałkowego sklepienia czaszki myszy wykonuje się nacięcie skóry o długości 8 mm. Następnie, za pomocą patyczka higienicznego, delikatnie usuwa się okostną sklepienia czaszki.</li>
	<li>Następnie, używając wiertła trepanacyjnego z powłoką diamentową w wysokoobrotowym wiertle stomatologicznym, tworzy się ubytek w kości ciemieniowej o średnicy 4 mm. Ubytek jest pełnościenny, jednak należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej.</li>
	<li>W miejscu ubytku delikatnie umieszcza się wykonany na zamówienie implant na bazie PLGA z wszczepionymi komórkami PSCs. Gęstość komórek wynosi 2,5 x 105 na implant. Na koniec skórę zszywa się nicią 6-0 Vicryl. Po zabiegu zwierzęta otrzymują buprenorfinę przez 48 godzin oraz TMP/SMX przez 10 dni.</li>
</ol>
5. Implementacja modelu ubytku segmentowego kości udowej
<ol>
	<li>Szczury atypiczne (w wieku 12-14 tygodni) poddaje się znieczuleniu za pomocą inhalacji izofluranem. Kość udową przeciera się i przygotowuje zgodnie ze standardowym protokołem przy użyciu betadyny (Rysunek 1).</li>
	<li>W przednio-bocznej części kości udowej wykonuje się nacięcie podłużne o długości 27-30 mm. Następnie odsłania się trzon kości udowej poprzez rozdzielenie mięśnia obszernego bocznego i mięśnia dwugłowego uda (Rysunek 2).</li>
	<li>Aby zmaksymalizować powtarzalność regeneracji kości, okostną pokrywającą ubytek w kości udowej usuwa się całkowicie wraz z wyresekcjonowanym segmentem kości udowej.</li>
	<li>Na powierzchni przednio-bocznej kości udowej umieszcza się płytkę polietylenową (długość 23 mm; szerokość 4 mm; wysokość 4 mm). Płytka posiada sześć nawierconych otworów przeznaczonych dla gwintowanych drutów Kirschnera o średnicy 0,9 mm (Zimmer). Wykorzystując płytkę jako szablon, sześć gwintowanych drutów Kirschnera wprowadza się przez płytkę i obie warstwy kory kostnej (Rysunek 3).</li>
	<li>Następnie, za pomocą małego oscylującego ostrza piły (Stryker, MI), tworzy się 6-mm ubytek w środkowej części trzonu. Ubytki segmentowe są następnie leczone poprzez wprowadzenie implantów na bazie PLGA, które zostały obsiane komórkami zgodnie z protokołem (Rysunek 4).</li>
	<li>Znajdujące się powyżej mięśnie i powięź zamyka się za pomocą wchłanialnych szwów Vicryl 4-0, aby unieruchomić implant w miejscu, a następnie zszywa się skórę.</li>
</ol>
6. Oceny in vivo
<ol>
	<li>Oceny radiograficzne są przeprowadzane w sposób podłużny, wykorzystując zarówno RTG o wysokiej rozdzielczości, jak i analizę μCT (mikrotomografii komputerowej) o wysokiej rozdzielczości. W analizie μCT (Skyscan 1172F) obrazy są skanowane z rozdzielczością 19,73 μm (źródło promieniowania 100 kV i 100 mA, z zastosowaniem filtra aluminiowego 0,5 mm). Obrazy są analizowane przy użyciu oprogramowania DataViewer, Recon, CTAn oraz CTVol.</li>
	<li>Obrazowanie bioluminescencyjne jest również wykonywane seryjnie w celu oceny przyjęcia przeszczepu komórkowego, żywotności, proliferacji oraz wykluczenia migracji poza miejsce implantu. Obrazowanie bioluminescencyjne jest realizowane za pomocą urządzenia IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Emisję światła kwantyfikuje się przy użyciu oprogramowania Living Image (Xenogen). Całkowita emisja światła jest zapisywana w fotonach/sekundzie/cm²/steradianie.</li>
	<li>Analizy histologiczne i histomorfometryczne są przeprowadzane pośmiertnie. Stosowane rutynowe barwienia obejmują trichrom Massona, błękit anilinowy, pentachrom oraz czerwony Picrosirius. Analizę histomorfometryczną wykonuje się łatwo przy zastosowaniu barwienia błękitem anilinowym lub pentachromem, w których osteoida wykazuje odpowiednio ciemnoniebieski i żółty kolor. Liczbę pikseli na pole widzenia przy dużym powiększeniu oblicza się za pomocą narzędzia magiczna różdżka w programie Adobe Photoshop.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Ponieważ zarówno ubytki w sklepieniu czaszki, jak i w kości udowej są ubytkami krytycznymi, nie należy spodziewać się znaczącego gojenia bez zastosowania czynników wzrostu lub egzogennych komórek macierzystych.
W odniesieniu do manewrów chirurgicznych, wypreparowanie kieszonki mięśniowej powinno przebiegać wzdłuż płaszczyzn powięziowych, dzięki czemu krwawienie powinno być minimalne. Mimo że model kieszonki mięśniowej jest wykonywany obustronnie, mysz powinna bez problemu poruszać się w 1. dobie po operacji. W przypadku defektu sklepienia czaszki występuje krwawienie, które można tamponować za pomocą patyczka higienicznego. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej, ponieważ zakłóci to prawidłowy proces gojenia. W modelu FSD należy uważać, aby nie uszkodzić głównych naczyń krwionośnych, co zapobiegnie nadmiernemu krwawieniu, oraz nerwu udowego, aby uniknąć uszkodzeń neurologicznych. Druty Kirschnera należy wprowadzać przy użyciu niewielkiego nacisku, aby nie uszkodzić w ten sposób kości korowej.
<img alt="Tekstura powierzchni tkanki, obraz mikroskopowy, analiza próbki biologicznej, badanie struktury komórkowej." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1."> 
Rysunek 1. Przygotowanie przedoperacyjne do wytworzenia ubytku segmentowego kości udowej (FSD) u szczurów atymicznych. Samce szczurów (w wieku 12–14 tygodni) są znieczulone w drodze inhalacji izofluranu. Kość udową oczyszczono i przygotowano zgodnie ze standardowym protokołem przy użyciu betadyny.
<img alt="Cięcie chirurgiczne ukazujące anatomię mięśni w procedurze weterynaryjnej, z zaznaczeniem warstw tkankowych." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2."> 
Rysunek 2. Dojście chirurgiczne w celu utworzenia ubytku segmentowego kości udowej (FSD). Wykonuje się podłużne cięcie o długości 27-30 mm nad przednio-boczną powierzchnią kości udowej. Następnie odsłania się boczną stronę trzonu kości udowej poprzez rozdzielenie mięśnia obszernego bocznego oraz mięśnia dwugłowego uda.
<img alt="Eksperyment z implantem chirurgicznym, obraz przedstawiający medyczne urządzenie do fiksacji w tkance miękkiej." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3."> 
Rysunek 3. Fiksacja przy tworzeniu segmentowego ubytku kości udowej (FSD). Płytkę polietylenową (długość 23 mm, szerokość 4 mm, wysokość 4 mm) umieszcza się na powierzchni przedniobocznej kości udowej. Płytka posiada sześć nawierconych otworów przeznaczonych dla gwintowanych drutów Kirschnera o średnicy 0.9 mm. Wykorzystując płytkę jako szablon, sześć gwintowanych drutów Kirschnera wprowadza się przez płytkę i obie kory kostne. Następnie tworzy się 6 mm ubytek w części środkowej trzonu kości. Po wykonaniu tego kroku bezpośrednio wprowadza się wykonowany na zamówienie rusztowanie (scaffold), które dokładnie pasuje do miejsca ubytku (nie pokazano).
<img alt="Obraz biopsji błony śluzowej jamy ustnej, przedstawiający patologię tkanki do analizy diagnostyki medycznej." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4."> 
Rycina 4. Przykład pooperacyjnego defektu sklepienia czaszki. U myszy atymicznych w prawej kości ciemieniowej utworzono okrągły defekt sklepienia czaszki o średnicy 4 mm. Przedstawione zdjęcie obrazuje miejsce defektu po implantacji PSC w 8. tygodniu po operacji. Zwróć uwagę na obecność nowej kości w obrębie miejsca defektu.

<ol><li>Crisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).</li>
<li>Chen, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+multi-lineage+progenitor+cells+in+human+organs%3A+regenerative+units%2C+cytokine+sources+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).</li>
<li>Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+ancestors+of+adult+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).</li>
<li>Zara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nell-1+enhances+bone+regeneration+in+a+rat+critical+sized+femoral+segmental+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22Plast.+Reconstr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model.</a> Plast. Reconstr. Surg. , Forthcoming (2010).</li>
<li>James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+Effects+of+Freezing+on+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo.</a> Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).</li>
<li>Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+delivery+from+modular+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).</li>
<li>Aghaloo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+role+of+nell-1+gene+modified+goat+bone+marrow+stromal+cells+in+promoting+new+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation.</a> Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).</li>
<li>Levi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+Stimulate+Autogenous+Skeletal+Repair+via+Paracrine+Hedgehog+Signaling+with+Calvarial+Osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts.</a> Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).</li>
<li>Leucht, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+and+Hox+status+determine+progenitor+cell+fate+during+adult+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration.</a> Development. 135, 2845-2854 (2008).</li>
<li>Rajashekhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Adipose+stromal+cell+differentiation+is+reduced+by+endothelial+cell+contact+and+paracrine+communication%3A+role+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling.</a> Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).</li>
<li>Zuk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
</ol>

K.T, B.P. i C.S. są wynalazcami patentów związanych z perivaskularnymi komórkami macierzystymi zgłoszonych przez UCLA. Dr K.T i dr C.S. są założycielami firmy Scarless Laboratories Inc., która posiada sublicencje na patenty związane z perivaskularnymi komórkami macierzystymi od UC Regents. Dr Chia Soo jest również członkiem zarządu Scarless Laboratories, Inc.

Izolacja PSC jest dobrze opisana w innych źródłach1-3, w tym w oddzielnie przesłanej publikacji JoVE poświęconej konkretnie protokołom i metodom izolacji PSC. Specyficznym celem niniejszego artykułu jest opisanie i zademonstrowanie trzech protokołów zastosowania PSC in vivo w celu formowania/regeneracji kości. Torebka mięśniowa myszy SCID jest powszechnie opisywanym modelem ektopowego formowania ludzkiej kości7. Istnieją istotne różnice między modelami ektopowymi a ortotopowymi (defektu) kości, w tym interakcje parakrynne z komórkami gospodarza tworzącymi kość8, a także obfitość osteogennych czynników sygnałowych obecnych w mikrośrodowisku defektu szkieletowego. W niniejszej pracy przedstawiono dwa defekty: defekt sklepienia czaszki8 oraz segmentowy defekt kości udowej4. W obu przypadkach dobrze udokumentowano, że są to defekty o rozmiarze krytycznym (tj. nie zagoją się samoistnie).
Istnieją interesujące różnice między defektami sklepienia czaszki a defektami kości udowej. Po pierwsze, oddziaływanie komórka-komórka między ksenoprzeszczepionymi PSC a komórkami endogennymi jest bardzo odmienne. W przypadku defektu sklepienia czaszki PSC oddziałują z leżącą pod nimi oponą twardą (zewnętrzną warstwą opon mózgowych), a także z osteoblastami i komórkami okostnej otaczającymi miejsce defektu. Co istotne, interakcje między zaimplantowanymi komórkami a otaczającymi je osteoblastami8 lub między zaimplantowanymi komórkami a leżącą pod nimi oponą twardą (Levi et al., w druku) są kluczowe dla przebiegu prawidłowej osteogenezy indukowanej przez komórki macierzyste. W przypadku segmentowego defektu kości udowej (FSD) ksenoprzeszczepione PSC są narażone na zupełnie inne środowisko komórkowe i cytokinowe. Na przykład miejsce FSD składa się ze szpiku i towarzyszących mu mezenchymalnych komórek macierzystych, a także z endosteum, okostnej i osteoblastów kości długich. Teoretycznie każda komórka wykazuje własną reakcję na uraz i każda z nich może wchodzić w interakcje komórka-komórka z ksenoprzeszczepami PSC.
Istnieją inne wyraźne różnice między ubytkami w obrębie sklepienia czaszki a ubytkami w kości udowej. Kości sklepienia czaszki powstają początkowo w procesie kostnienia błonowego, podczas gdy kości długie tworzą się poprzez pośrednictwo chrząstki (kostnienie chrzęstne). Co więcej, proces naprawczy po urazie również odzwierciedla te pochodzenia rozwojowe. Po FSD obserwuje się tworzenie kostni chrzęstnego, podczas gdy w ubytku kości ciemieniowej nie powstaje żadne pośrednictwo chrzęstne. Wreszcie, pochodzenie embrionalne czaszki może różnić się od pochodzenia kości długich. Większość czaszki (w tym komórki okołonaczyniowe – perycyty – w całym obszarze głowy) pochodzi z grzebienia neuronalnego (mezektodermy), podczas gdy szkielet kończyn wywodzi się z mezodermy paraksialnej9. Wszystkie te różnice mogą prowadzić do istotnych rozbieżności w zakresie naprawy kości pośredniczonej przez PSC.
 Stosowanie PSC niesie ze sobą szereg korzyści w porównaniu do tradycyjnych mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC). PSC nie wymagają hodowli i stanowią oczyszczoną populację komórek, która nie zawiera innych komórek zrębu nieuczestniczących w różnicowaniu osteogenicznym – a wręcz mogących je negatywnie regulować – takich jak komórki śródbłonka10. W przeciwieństwie do nich, na przykład analizy klonalne ASC wykazują, że tylko subpopulacja tych komórek jest zdolna do różnicowania osteogenicznego in vitro11. W perspektywie długoterminowej działania w zakresie inżynierii tkanki szkieletowej będą prawdopodobnie łączyć osteokompetentne komórki macierzyste (takie jak PSC) z egzogennymi czynnikami wzrostu oraz rusztowaniem osteokondukcyjnym (takim jak HA-PLGA zastosowane w niniejszych metodach), aby w optymalny sposób leczyć ubytki szkieletowe.

zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Ludzkie peryvaskularne komórki macierzyste (PSCs) można wyizolować w wystarczającej liczbie z wielu tkanek na potrzeby inżynierii tkanki szkieletowej1-3. PSCs stanowią populację sortowaną metodą FACS, składającą się z „perycytów” (CD146+CD34-CD45-) oraz „komórek adwentycjalnych” (CD146-CD34+CD45-), z których każda, jak wykazaliśmy wcześniej, posiada właściwości mezenchymalnych komórek macierzystych. PSCs, podobnie jak MSCs, są zdolne do różnicowania osteogennego oraz wydzielania cytokin pro-osteogennych1,2. W niniejszym protokole demonstrujemy osteogenność PSCs w kilku modelach zwierzęcych, w tym poprzez implantację do kieszonki mięśniowej u myszy SCID (z ciężkim złożonym niedoborem odporności), w modelu ubytku sklepienia czaszki u myszy SCID oraz w modelu segmentowego ubytku kości udowej (FSD) u szczurów atymicznych. Model kieszonki w mięśniu uda jest wykorzystywany do oceny ektopowego tworzenia kości. Ubytki sklepienia czaszki są centrowane na kości ciemieniowej i mają standardowo średnicę 4 mm (ubytki o rozmiarze krytycznym)8. FSD są ubytkami bikortykalnymi, stabilizowanymi prętem polietylenowym i drutami K-wires4. Opisany FSD jest również ubytkiem o rozmiarze krytycznym, który nie goi się znacząco samoistnie4. W przeciwieństwie do tego, po dodaniu komórek macierzystych lub czynników wzrostu do miejsca ubytku, można zaobserwować znaczną regenerację kości. Ogólnym celem ksenoprzeszczepów PSCs jest wykazanie potencjału osteogennego tego typu komórek zarówno w ektopowych, jak i ortotopowych modelach regeneracji kości.

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Ludzkie komórki macierzyste okołynaczyniowe (PSC) mogą być izolowane w wystarczających ilościach z wielu tkanek na potrzeby inżynierii tkanki szkieletowej1-3. PSC są ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja efektów implantacji okołynacznych komórek macierzystych w modelach ektopowego i ortotopowego różnicowania kostnego. Osiąga się to poprzez wstępne wyizolowanie komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej z wykorzystaniem technologii FACS. Następnie wytwarzane są niestandardowe rusztowania, które zapewniają powierzchnię do różnicowania komórek w środowisku ektopowym lub ortotopowym.Aby przetestować tworzenie kości pośredniczone przez PSC, tworzy się defekty szkieletowe z wykorzystaniem modelu woreczka mięśniowego myszy skid, modelu sklepienia czaszki myszy skid lub modelu ubytku segmentowego kości udowej szczura atymicznego, a następnie w miejscu defektu umieszcza się wszczepiony rusztowanie. Analizy radiograficzne, histologiczne i biochemiczne wykazują, że różnicowanie peryvaskularnych komórek macierzystych prowadzi do znaczącego tworzenia kości in vivo. Główną zaletą stosowania peryvaskularnych komórek macierzystych w porównaniu z innymi, bardziej tradycyjnymi źródłami komórek macierzystych jest to, że PSC, czyli peryvaskularne komórki macierzyste, stanowią bardziej jednorodną populację, co zwiększa czystość komórek macierzystych, nasila produkcję czynników troficznych i potencjalnie zwiększa tworzenie tkanki kostnej.Zacznij od stworzenia rusztowania zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Przygotuj rusztowanie do implantacji, dodając do niego zawiesinę komórkową. W przypadku modeli woreczka mięśniowego u myszy lub defektu sklepienia czaszki, po znieczuleniu zastosuj gęstość 250 000 komórek na 100 µL.Sześciotygodniowe myszy SCID znieczulono izofluranem i buprenorfiną. Kończyn tylnych poddano standardowemu przygotowaniu za pomocą Betadiny. Następnie wykonano dwumilimetrowe, podłużne nacięcia obustronne, a za pomocą rozwarstwiania tępego wycięto kieszonki o głębokości czterech milimetrów w mięśniach dwugłowych uda.Równolegle do włókna mięśniowego powinno wystąpić jedynie minimalne krwawienie. Wprowadź implant z wszczepionymi PSCs. Następnie zaszyj powięź nadlegającą nad mięśniem prostym szwem ciągłym, używając nici Vicryl 5-0.Następnie zamknij skórę nicią 5-0 Vicryl w szwie śródskórnym. Po zabiegu podawaj zwierzętom buprenorfinę przez 48 godzin oraz T-M-P-S-M-X przez 10 dni. Mysz powinna swobodnie chodzić w pierwszym dniu po operacji.Po znieczuleniu izofluranem myszy szczepu skid w wieku od 12 do 14 tygodni, należy przeprowadzić standardową preparację regionu sklepienia czaszki za pomocą Betadyny. Następnie należy wykonać nacięcie skóry o długości ośmiu milimetrów wzdłuż szwu pośrodkowego na sklepieniu czaszki myszy.Następnie delikatnie usuń okostną czaszki za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem i użyj aplikatora do wchłonięcia krwi. Teraz, używając diamentowego wiertła trepanacyjnego zamocowanego do stomatologicznego wiertła wysokobiegowego, wykonaj czteromilimetrowy defekt kości ciemieniowej. Wykonaj defekt o pełnej grubości, przechodząc całkowicie przez kość, ale zachowaj najwyższą ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej, ponieważ utrudni to proces gojenia.Następnie delikatnie umieść implant z przeszczepionymi PSC w miejscu ubytku. Na koniec zaszyj skórę szwem 6-0 Vicryl po zabiegu. Podawaj zwierzętom buprenorfinę przez 48 godzin oraz T-M-P-S-M-X przez 10 dni.Zacznij od oczyszczenia i przygotowania kości udowej szczura szczepu amic w wieku od 12 do 14 tygodni, który został poddany znieczuleniu izofluranem. Zastosuj standardowy protokół z użyciem Betadinu. Wykonaj nacięcie podłużne o długości od 27 do 30 mm nad przednio-boczną częścią kości udowej.Następnie odsłoń trzon kości udowej, rozdzielając mięsień obszerny boczny i mięsień dwugłowy uda, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Zachowaj ostrożność w pobliżu głównych naczyń krwionośnych. Aby zmaksymalizować spójność regeneracji kości, całkowicie.Usuń okostną pokrywającą defekt kości udowej wraz z wyresekcowanym segmentem kości udowej. Unikaj uszkodzenia nerwu udowego, aby zapobiec uszkodzeniom neurologicznym. Następnie umieść płytkę polietylenową na przednio-bocznej powierzchni kości udowej.Sześć nawierconych otworów w płytce przyjmuje gwintowane druty Kirschnera o średnicy 0,9 milimetra. Wykorzystując płytkę jako szablon, wywiercono sześć gwintowanych drutów Kirschnera przez płytkę oraz obie kory kostne. Za pomocą małego ostrza piły oscylacyjnej wykonano defekt w części środkowej o szerokości sześciu milimetrów.Następnie zaimplantuj PSC oraz przeszczepione rusztowanie w miejsce ubytku. Zamknij znajdujące się powyżej mięśnie i powięź, używając wchłanialnych szwów Vicryl o rozmiarze 4-0. Aby zabezpieczyć implant w miejscu podania, podawaj szczurowi leki przeciwbólowe przez dwa dni po operacji i monitoruj go pod kątem rozpadu rany przez cztery tygodnie po implantacji do kieszeni mięśniowej.Obserwowano stopniowy wzrost objętości kości oraz gęstości mineralnej kości w przypadku przeszczepienia PSC, co potwierdzono w analizie mikro-CT oraz XR w ciągu ośmiu tygodni od wprowadzenia defektu kalwarialnego; bez zastosowania rusztowania nie zaobserwowano gojenia kości ze względu na krytyczną wielkość defektu. W grupie z rusztowaniem, ale bez komórek, odnotowano niewielkie gojenie szacowane na około 20%, zgodnie z oczekiwaniami. W przypadku rusztowania z zasianymi komórkami zaobserwowano stopniowy wzrost kostnienia defektu.Główny proces kostnienia nastąpił w ciągu dwóch tygodni. Pełne kostnienie zaobserwowano do ósmego tygodnia po wprowadzeniu defektu kości udowej. Stopniowy wzrost kostnienia występował w przypadku leczenia defektu za pomocą BMP 2; u niektórych zwierząt zrost zaobserwowano już w czwartym tygodniu, a do ósmego tygodnia wszystkie zwierzęta zostały wyleczone.W przeciwieństwie do poprzednich przypadków, nie zaobserwowano zrostu kostnego bez zastosowania rusztowania lub w przypadku rusztowania pozbawionego komórek bądź rekombinowanego białka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat izolacji peryvaskularnych komórek macierzystych, sposobu ich wykorzystania w połączeniu z osteoindukcyjnymi rusztowaniami PLGA oraz końcowego zastosowania tych produktów łączonych (rusztowania i komórek) w trzech różnych metodach inżynierii tkankowej. Przystępując do każdej z zaprezentowanych procedur, należy pamiętać o kilku istotnych kwestiach. Po pierwsze, w modelu defektu sklepienia czaszki precyzyjne zachowanie opony twardej gwarantuje prawidłowy przebieg procesu gojenia.Po drugie, w przypadku modelu ubytku segmentowego kości udowej szczura ważne jest zminimalizowanie urazów otaczających nerwów i naczyń krwionośnych. Po opanowaniu przez operatora konkretnej techniki chirurgicznej przedstawionej w niniejszym materiale można oczekiwać, że każda implantacja woreczka mięśniowego zajmie około 20 minut, natomiast wykonanie każdego ubytku sklepienia czaszkowego oraz ubytku segmentowego kości udowej może zająć do 30 minut.

use-of-human-perivascular-stem-cells-for-bone-regeneration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zastosowanie ludzkich komórek macierzystych okołonaczyniowych do regeneracji kości

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych (hMSC) za pomocą autologicznej surowicy, zmniejsza ryzyko odrzucenia przez materiał ksenogeniczny i inne negatywne skutki. Pozwala również na odzyskanie podzbioru mezodermalnych komórek progenitorowych, które mogą dostarczać świeże hMSC. Osadzenie hMSC w autologicznym skrzepie fibrynowym umożliwia łatwą obsługę i skuteczną implantację chirurgiczną.

Mezenchymalna hodowla komórek zrębowych i dostarczanie w warunkach autologicznych: inteligentne podejście do zastosowań ortopedycznych

Komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być przydatne do inżynierii nowej tkanki z własnych komórek pacjenta. Przedstawiamy protokół izolacji subpopulacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) o zwiększonym potencjale osteogennym, a następnie zastosowania komórek w teście gojenia kalwaryjnego in vivo.

Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Przedstawiamy protokół do zbadania biomarkerów ekspresji mRNA komórek pochodzących z okostnej (PDC) indukowanych przez witaminę C (witaminę C) i 1,25-dihydroksywitaminę D [1,25-(OH)2D3]. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Poznaj izolację okołonaczyniowych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i ich zastosowanie w regeneracji kości. Metoda obejmuje hodowlę z rusztowaniami oraz modele zwierzęce w celu oceny osteogenezy in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Przeglądaj więcej filmów