Name: Izolacja wariantów wierności wirusów RNA i charakterystyka częstości mutacji wirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 10 s
Description: Poznaj metodę izolacji wariantów wierności polimeraz wirusów RNA i charakterystykę częstości mutacji. Technika ta pozwala identyfikować mutacje wpływające na błędy replikacji wirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana finansowo z grantu Medical and Health Research przyznanego przez miasto Paryż, francuskiego grantu narodowego ANR-09-JCJC-0118-1 oraz grantu ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax, projekt nr 242719.

<ol><li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+%28in%29fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li>
<li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li>
<li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%3A+fidelity%2C+replication+speed%2C+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li>
<li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li>
<li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li>
<li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribavirin%27s+antiviral+mechanism+of+action%3A+lethal+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li>
<li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li>
<li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li>
<li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li>
<li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect%2C+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li>
<li>Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis%3A+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li>
<li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li>
<li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin%3A+implications+for+error+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wybór linii komórkowej. Skuteczność analogów zasad jako mutagenów RNA koreluje z ich względnym poborem przez różne typy komórek 11. Jeśli linia komórkowa zwykle stosowana do pasażowania wirusa okaże się oporna na pobór mutagenu lub zbyt wrażliwa (wysoka toksyczność komórkowa), konieczne może być zastosowanie innej linii komórkowej, która spełnia te wymagania i nadal jest dopuszczalna dla replikacji wirusa. Po wyizolowaniu wariantu opornego na mutagen, pozostałą część charakterystyki można przeprowadzić w oryginalnej, preferowanej linii komórkowej. W naszym doświadczeniu komórki HeLa łatwo pobierają mutagen; komórki BHK wymagają do 10-krotnie wyższych stężeń, a komórki Vero są oporne na pobór mutagenu.
Wybór mutagenu. Przy próbie izolacji wariantów wiernościowych poprzez traktowanie mutagenami, prawdopodobieństwo sukcesu wzrasta, jeśli zastosuje się więcej niż jeden rodzaj mutagenu. Mutageny będące analogami zasad o różnej strukturze, które są błędnie włączane do genomów podczas replikacji, będą indukować przede wszystkim specyficzny podzbiór mutacji w kolejnych cyklach replikacyjnych: traktowanie rybawiryną sprzyja mutacjom przejścia GdoA i CdoU 12; 5-azacytydyna wykazuje podobną tendencję, z dodatkiem transwersji CdoG i GdoC 13; 5-fluorouracyl preferencyjnie indukuje przejścia AtoG i UdoC 14. Alternatywnie, do pożywki można dodać wyższe stężenia Mg2+ lub Mn2+, aby zwiększyć ogólną częstość mutacji wirusów RNA bez opisywanej powyżej stronniczości 12. W zależności od sekwencji kodonów wirusa oraz zmian w kodonach wymaganych do wygenerowania wariantu wiernościowego, niektóre z tych warunków będą sprzyjać pojawieniu się tego konkretnego wariantu bardziej niż inne. W przypadku wariantów o wyższej wierności, poliovirus G64S i wirus Coxsackie A372V, traktowanie rybawiryną najskuteczniej pozwoliło na selekcję wariantów, ponieważ wymagane przejście AtoG w miejscu kodonu odpowiadało mutacjom generowanym głównie przez rybawirynę.
MOI a wielkość populacji. W wirusologii protokoły zakażania kultur tkankowych zwracają szczególną uwagę na wielokrotność zakażenia (MOI), aby na przykład uniknąć akumulacji wadliwych cząstek interferujących (niskie MOI) lub promować rekombinację między wirusami (wysokie MOI). Aby wyselekcjonować zdarzenia wyłaniania się nowych wariantów podczas seryjnego pasażowania, istotne jest również uwzględnienie wielkości populacji wirusa. Ponieważ mutant oporny występuje początkowo z niską częstotliwością, najlepiej jest przenosić jak największą populację z jednego pasażu do kolejnego (np. 105-106 wirusów), aby uniknąć utraty tych wyłaniających się wariantów przy każdym pasażu. Zwiększenie rozmiaru dołka lub kolby (liczby zakażonych komórek) może pomóc zminimalizować wzrost MOI, jeśli jest to kwestia problematyczna. Z drugiej strony, w eksperymentach badających wrażliwość wirusa na mutagen, przeprowadza się zakażenie przy niskim MOI, aby zwiększyć liczbę cykli replikacyjnych zachodzących w eksperymencie oraz uniknąć ratowania zmutagenizowanych genomów przez genomy o wyższej sprawności (fitness) poprzez komplementację w komórkach współzakażonych. Jest to ważne, ponieważ mutacje powstałe w genomach potomstwa podczas pierwszej rundy replikacji nie zostaną wykryte natychmiast. Większość tych zmutagenizowanych RNA zostanie nadal zapakowana do wirionów. Dopiero w kolejnej rundzie zakażenia mutacje letalne obecne w tych genomach spowodują przerwanie cyklu replikacyjnego i spadek miana wirusa. Może być konieczne dopuszczenie kilku rund akumulacji mutacji, zanim zaobserwuje się istotny efekt mutagenezy letalnej. Wreszcie, jeśli w serii pasażowań w obecności mutagenu miana wirusa stale spadają aż do całkowitego wygaśnięcia, badacz powinien spróbować pasażować wirusa w stopniowo zwiększanych ilościach mutagenu (zaczynając od bardzo niskiego stężenia).
Izolacja i generowanie klonu opornego na mutageny RNA z populacji opornej na mutageny RNA. Mutageny RNA wprowadzają liczne, losowe mutacje do każdego genomu, jednak selekcja w kierunku oporności wzbogaci (i utrwali w sekwencji konsensusowej) jedynie mutację odpowiedzialną za oporność. Aby zidentyfikować tę mutację, sekwencjonujemy populację oporną na mutageny (konsensus populacji), a nie poszczególne wirusy. W konsekwencji pojedyncze, losowe mutacje wywołane przez mutagen nie są wykrywane w sekwencji; odnajduje się jedynie te mutacje, które prowadzą do zmian w konsensusie po selekcji. W naszym doświadczeniu identyfikujemy zazwyczaj tylko jedną lub dwie takie zmiany w sekwencji konsensusowej. Po uzyskaniu populacji opornej na mutageny i zidentyfikowaniu mutacji oporności konieczne jest wygenerowanie czystszego zapasu tego wariantu. Powyżej opisaliśmy procedurę oczyszczania metodą płytek (plaque purification). Alternatywnie, jeśli badany wirus nie tworzy łatwo identyfikowalnych płytek, pożądany wariant można oczyścić metodą rozcieńczeń ograniczających. Podejście to jest w istocie wyznaczeniem TCID50 w formacie 96-dołkowym, gdzie zapas wirusa jest rozcieńczany tak, aby zainfekowanych zostało mniej niż 50% dołków. Przy zastosowaniu tego rozcieńczenia stosuje się taką samą metodę jak opisano powyżej, izolując do 10 pojedynczych wariantów i potwierdzając ich sekwencje. Jak wspomniano, w najlepszych przypadkach dostępny jest infekcyjny klon cDNA szczepu wirusa. Wówczas izolacja wariantu nie byłaby konieczna. Z naszego doświadczenia wynika, że warianty wierności replikacji są wynikiem pojedynczych podstawień aminokwasowych i mogą być zatem generowane przy użyciu prostych, komercyjnych zestawów do mutogenezy, takich jak Quikchange (Agilent). Drugą opcją jest wykorzystanie klona cDNA blisko spokrewnionego szczepu. Jeśli jednak używany jest szczep pokrewny, zdecydowanie zalecamy zastosowanie zarówno tego podejścia, jak i izolacji wirusa (np. oczyszczania metodą płytek), ponieważ stwierdziliśmy, że ta sama mutacja zmieniająca wierność replikacji w dwóch blisko spokrewnionych wirusach niekoniecznie wywoła ten sam efekt.
Wierność i replikacja. Selekcja wariantów RNA odpornych na mutageny doprowadziła do wyizolowania wariantów o zarówno wyższej, jak i niższej wierności, których charakterystyka wzrostu jest podobna do ich odpowiedników typu dzikiego 4,12,15. Obecnie związek między szybkością aktywności polimerazy a wiernością nie jest w pełni zrozumiały. Badania biochemiczne in vitro z użyciem oczyszczonej polimerazy RNA wykazały, że warianty o wyższej wierności charakteryzują się wolniejszą szybkością przetwarzania, podczas gdy warianty o niższej wierności mają tendencję do szybszego przetwarzania 1-3,12. W hodowlach tkankowych różnice te zazwyczaj nie są widoczne, co sugeruje, że etapem ograniczającym tempo jest dostępność zasobów, a nie wewnętrzna kinetyka aktywności polimerazy. Jeśli wariant o określonej wierności replikuje się z kinetyką, która nie różni się znacząco od typu dzikiego, można bezpośrednio porównać częstotliwości ich mutacji. W przypadku wystąpienia bardzo znaczącej zmiany w kinetyce replikacji dane należy znormalizować, aby uwzględnić różnice kinetyczne, na przykład poprzez porównanie wirusów, które przeszły tę samą liczbę cykli replikacyjnych. W naszym doświadczeniu, mimo że nie zaobserwowano znaczących różnic w kinetyce wzrostu jednokrokowego między typem dzikim a wariantami o wysokiej wierności, zauważyliśmy, że warianty o wyższej wierności konsekwentnie osiągają wyższe miana (w granicach 1 log) w porównaniu z typem dzikim, ale produkują nieco mniej RNA (w tym samym rzędzie wielkości), co dodatkowo sugeruje, że produkowane przez nie genomy zawierają mniej mutacji i są zatem bardziej zakaźne.
Przygotowanie próbek i sekwencjonowanie. W każdym z etapów opisanych w niniejszych protokołach niezbędne jest stosowanie wysokowiernych enzymów z aktywnością egzonukleazy (proof-reading) do reakcji PCR i RT-PCR, aby ograniczyć wprowadzanie dodatkowych mutacji, których nie można odróżnić od mutacji istotnych biologicznie. Kluczowe jest, aby porównywane populacje wirusów były przygotowane w tych samych warunkach (historia pasażowania, pożywka do hodowli tkankowej, temperatura, metoda ekstrakcji RNA, protokoły RT-PCR itp.). Ważne jest również upewnienie się, że z ekstrakcji RNA uzyskano wystarczającą ilość materiału wyjściowego, tak aby w wyniku RT-PCR powstał wyraźny prążek. Rozcieńczenie próbki RNA 1/100 powinno również dawać wykrywalny prążek w RT-PCR, co wskazuje, że próbka zawiera wystarczającą liczbę cząsteczek RNA, aby uniknąć błędu reprezentatywności (wielokrotnej amplifikacji tego samego genomu). Ponieważ częstość mutacji jest rozkładem, można oczekiwać uzyskania podobnych wartości niezależnie od wielkości populacji, pod warunkiem, że nie występuje wspomniany błąd. Jak pokazano na rysunku 6, 105-krotne rozcieńczenie zapasu wirusa daje częstość mutacji, która nie różni się znacząco od zapasu wyjściowego.
Do czasu ustalenia optymalnych warunków klonowania TopoTA, obecność wstawek po selekcji niebiesko-białej należy potwierdzić za pomocą kolonialnej PCR przed sekwencjonowaniem. W celu kontroli szumu mutacyjnego (mutacji wprowadzonych podczas RT-PCR i sekwencjonowania) należy sklonować produkt PCR z plazmidu zawierającego tę samą sekwencję wirusową i/lub sklonować oraz zsekwencjonować produkty RT-PCR z RNA przetranskrybowanego in vitro, odpowiadającego genomowi wirusa (należy pamiętać, że różne enzymy do transkrypcji in vitro mają różny stopień błędów i mogą nie dostarczyć przydatnych informacji na temat rzeczywistego poziomu błędów tła w danej procedurze). Niektóre sekwencje wirusowe mogą być toksyczne dla bakterii, dlatego ważne jest zweryfikowanie tego faktu przed wyborem regionu genomu wirusa do sekwencjonowania w celu oznaczenia częstości mutacji. Podczas analizy sekwencji uzyskanych metodą TopoTA należy pamiętać, że każdy klon powinien zawierać tylko jedną wstawkę/sekwencję. Jeśli zaobserwowany zostanie podwójny piki, co sugeruje mieszaną populację, możliwe jest, że wybrano dwie sąsiadujące kolonie bakteryjne. Możliwe jest również, choć wysoce nieprawdopodobne ze względu na niską częstotliwość mutacji podczas replikacji bakteryjnej, że mutacja została wprowadzona podczas amplifikacji plazmidu w kulturze bakteryjnej. W populacjach oczyszczonych metodą plackową podwójny piki może reprezentować nakładające się placki lub wirusa, który nabywa nową mutację bądź ulega rewersji mutacji podczas rozwoju placka. Należy zachować konsekwencję i zdecydować, czy uwzględniać takie mutacje w obliczeniach, czy nie.
Na koniec należy pamiętać, że wykorzystane tutaj częstotliwości mutacji są wartościami względnymi. Są one poprawne wyłącznie przy porównywaniu populacji wirusów hodowanych w tych samych warunkach i sekwencjonowanych w tym samym regionie! Nie należy ich traktować jako bezwzględnych wartości tempa mutacji ani częstotliwości mutacji całego genomu. Niemniej jednak, przy kontrolowanych warunkach, pozwalają one na powtarzalne, ilościowe porównania różnic w rozkładzie i częstotliwości mutacji.

<table><tbody><tr><td>rybawiryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9644-10MG</td><td></td></tr><tr><td>5-fluorouracyl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6627-1G</td><td></td></tr><tr><td>5-azacytydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2385-100MG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1787</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do klonowania TopoTA</td><td>Invitrogen</td><td>10351021</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do mutagenezy Quikchange</td><td>Agilent Technologies</td><td>200516</td><td>Jeśli dostępny jest infekcyjny klon cDNA</td></tr><tr><td>zestaw do minipreparatyki w 96 dołkach</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740625</td><td></td></tr><tr><td>Lasergene, Sequencher</td><td>DNASTAR</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dnastar.com">www.dnastar.com&lt;/a&gt; &lt;a href=&quot;http://www.genecodes.com">www.genecodes.com&lt;/a&gt;</td><td>Lub inne oprogramowanie do dopasowania sekwencji</td></tr></tbody></table>

izolacja wariantów wierności replikacji wirusów rna i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Wirusy RNA wykorzystują polimerazy RNA zależne od RNA do replikacji swoich genomów. Naturalnie wysoki wskaźnik błędów tych enzymów w dużym stopniu przyczynia się do generowania ogromnej różnorodności populacyjnej, co ułatwia adaptację i ewolucję wirusów. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że naturalne wskaźniki błędów i wynikające z nich częstotliwości mutacji wirusów RNA mogą być modulowane przez subtelne zmiany aminokwasowe w polimerazie wirusowej. Choć dla niektórych wirusowych polimeraz RNA istnieją testy biochemiczne umożliwiające ilościowy pomiar wierności inkorporacji, w niniejszej pracy opisujemy prostą metodę pomiaru częstotliwości mutacji wirusów RNA, która okazała się równie dokładna jak podejścia biochemiczne w identyfikacji mutacji zmieniających wierność. Podejście to wykorzystuje konwencjonalne techniki wirusologiczne i sekwencjonowanie, które mogą być przeprowadzone w większości laboratoriów biologicznych. W oparciu o nasze doświadczenia z wieloma różnymi wirusami zidentyfikowaliśmy kluczowe etapy, które muszą zostać zoptymalizowane, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wyizolowania wariantów o zmienionej wierności i wygenerowania danych o istotności statystycznej. Izolacja i charakterystyka mutacji zmieniających wierność mogą dostarczyć nowych informacji na temat struktury i funkcji polimerazy1-3. Ponadto warianty te mogą być użytecznymi narzędziami w charakteryzowaniu mechanizmów adaptacji i ewolucji wirusów4-7.

Niniejszy artykuł opisuje kroki niezbędne do izolacji i charakterystyki wariantów polimerazy RNA o różnym stopniu wierności replikacji w przypadku wirusów RNA oraz sposób wykorzystania danych o częstotliwości mutacji do potwierdzenia zmian wierności w hodowlach tkankowych.

Izolacja wariantów wierności replikacji wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa

Wirusy RNA wykorzystują polimerazy RNA zależne od RNA do replikacji swoich genomów. Naturalnie wysoki wskaźnik błędów tych enzymów w znacznym stopniu przyczynia się do...

Wirusy RNA wykorzystują kodowane wirusowo polimerazy RNA do replikacji swoich genomów. Polimerazy te charakteryzują się naturalnie wyższym wskaźnikiem błędów, co pozwala wirusowi na szybką adaptację i ewolucję. W niniejszym filmie przedstawiono zoptymalizowaną metodę przesiewową służącą do identyfikacji wirusów z mutacjami w polimerazie RNA, które wpływają na wskaźnik błędów lub wierność replikacji.W pierwszej kolejności do komórek gospodarza wirusa stosuje się mutageny, aby określić maksymalne stężenie mutagenu, które można zastosować bez zabijania komórek lub hamowania wirusa. Po ustaleniu optymalnych warunków wirusa pasażuje się pod presją selekcyjną mutagenów RNA. Następnie populację oporną na mutagen poddaje się sekwencjonowaniu w celu zidentyfikowania odpowiedzialnej za to mutacji.Następnie izoluje się mutant odporny na mutagen. Monitorowana jest kinetyka replikacji, a wyniki wykazują wzrost lub spadek wierności polimerazy. Towarzyszy temu szeroka odporność na mutageny RNA oraz zmiany w częstotliwości mutacji w populacji wirusa.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza wierności biochemicznej z użyciem oczyszczonych polimeraz, jest fakt, że techniki te są aktualne dla każdego wirusa RNA, który może być hodowany w kulturach tkankowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, takie jak rola szybkości polimerazy w adaptacji i ewolucji wirusa. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ stosowane przez nich presje selekcyjne są albo zbyt silne, albo zbyt słabe, a wielkość analizowanej próbki sekwencji regionu oraz liczba klonów nie zostały zoptymalizowane pod kątem mocy statystycznej.Rozpocznij ten eksperyment od określenia zakresu stężeń mutagenów, które mogą być stosowane w kolejnych badaniach bez powodowania śmierci komórek. Odsuń medium z sześciostudzienkowych płytek zawierających subkonfluencyjne monowarstwy komórek wątrobowych. Następnie dodaj dwa mililitry medium uzupełnionego o mutagen; w tym przypadku zastosowano mutageny: rybowcydynę, 5-fluorouracyl, 5-azacytydynę, chlorek magnezu oraz chlorek manganu.Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla. Następnie co 24 godziny przez kolejne dwa do siedmiu dni wykorzystaj jedną płytkę z komórkami do oceny żywotności metodą wykluczania błękitu trypanu. Używając komory countingowej, oblicz procent żywych komórek dla każdego stężenia mutagenu, wliczając w to warunki kontrolne bez traktowania, które skutkują śmiercią mniej niż 50% komórek w punkcie końcowym infekcji.Gdy osiągnięte zostaną idealne maksymalne miana, kolejnym krokiem procedury jest określenie stężenia mutagenu, które wywrze optymalną presję selekcyjną, nie powodując jednocześnie nadmiernej mutacji populacji przy odpowiednich stężeniachach. Każdy genom zostaje poddany mutacji w co najmniej jednej lub dwóch pozycjach. Mutagen wygeneruje zatem mutację oporności, która następnie zostanie wyselekcjonowana w kolejnych pasażach.Jeśli wprowadzonych zostanie zbyt wiele mutacji, mutanty posiadające mutację oporności same staną się letalne. Mutagen utrudnia ich izolację w płytkach 6-dołkowych zasiaianych komórkami. Do naszych komórek stosuje się 2 ml pożywki uzupełnionej mutagenem, używając tego samego zakresu stężeń co wcześniej, z wyłączeniem stężeń, które spowodowały śmierć ponad 50% komórek.Inkubować przez dwie godziny, aby umożliwić pobranie mutagenu, a następnie po inkubacji odessać pożywkę i zainfekować wirusem przy niskiej wielokrotności infekcji w 200 µL. Inkubować od 15 do 60 minut, aby wirus mógł zainfekować komórki, regularnie kołysząc płytką, aby zapewnić pokrycie monowarstwy komórkowej przez inokulum. Odessać inokulum wirusowe i przemyć dwukrotnie 2 mL PBS, aby usunąć jak największą ilość inokulum.Następnie do każdej studzienki dodaje się pożywkę z mutagenem i inkubuje komórki przez okres odpowiadający od trzech do sześciu cykli replikacyjnych, zazwyczaj od dwóch do siedmiu dni. Z każdej studzienki pozyskuje się wirusa, a następnie wykonuje standardowy test plackowy lub rozcieńczenie ograniczające, aby na podstawie obliczonych mian wyznaczyć efekt przeciwwirusowy w odniesieniu do miana wirusa. Określa się stężenie mutagenu, które obniża miana wirusa w porównaniu z nieleczoną kontrolą infekcji o 0,5 do dwóch logarytmów i jednocześnie nie wykazuje wysokiej toksyczności wobec komórek.W idealnym przypadku toksyczność powinna wynosić mniej niż 50%, aby wyizolować warianty oporne na mutageny. Należy rozpocząć od pasażowania wirusa w komórkach HeLa z optymalnym stężeniem każdego mutagenu; wirus może wymagać do 30 pasażów, przy czym w każdym pasażu należy oznaczyć miano wirusa i powtórzyć infekcję oraz inkubację z mutagenem, tak jak pokazano tutaj. Miana wirusa w próbkach traktowanych mutagenem powinny spaść podczas pierwszych kilku pasaży w porównaniu z pierwotnym mianem wirusa oraz mianami wirusa w kontroli nietraktowanej. Gdy miana wirusa dla danej serii osiągną tę samą wartość co miana w kontroli nietraktowanej, sugeruje to powstanie oporności.Wyizoluj wirusowe RNA do sekwencjonowania, używając starterów amplifikujących geny polimerazy lub replikazy interesującego wirusa. Uzyskaj cDNA genomu wirusowego metodą RT-PCR, a następnie przeprowadź sekwencjonowanie DNA. Po uzyskaniu informacji o sekwencji.Użyj oprogramowania do dopasowania sekwencji, aby zestawić uzyskane sekwencje z konsensusem referencyjnym i zidentyfikować nowe mutacje punktowe. Dodatkowo sprawdź chromatogramy pod kątem mniejszościowych pików, które mogły zostać pominięte przez oprogramowanie do dopasowania. Mutant reprezentujący od 20 do 30% całkowitej populacji nadal będzie widoczny jako pik, lecz zbyt mały, by zostać zidentyfikowanym jako mieszany nukleotyd podczas standardowej analizy sekwencji. Aby zidentyfikować interesującą mutację, szukaj polimorfizmów pojedynczego nukleotydu, które występują wyłącznie w populacji poddanej mutagenezie w porównaniu z nieleczoną kontrolą z tego samego pasażu, jak pokazano tutaj. Po zidentyfikowaniu mutacji wariant oporny musi zostać zregenerowany z zakaźnego cDNA lub wyizolowany w hodowli tkankowej, a następnie należy potwierdzić fenotyp oporności.W niniejszym kroku przeprowadzamy test plackowy w celu wyizolowania zidentyfikowanych mutantów. Przygotowujemy rozcieńczenia seryjne próbki odpornej na azot i nanosimy je na monowarstwy komórek w płytkach sześciodołkowych w celu wykonania testu plackowego po inkubacji przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2. Warstwę agarozy nakładamy od dwóch do pięciu dni po infekcji.Plamy powinny być wyraźnie widoczne. W idealnym przypadku na jednej z płytek powinno pojawić się od 10 do 50 dobrze oddzielonych plam. Zaznacz miejsce występowania plam na płytce kropką za pomocą markera, uważając, aby nie przesunąć ani nie z desloczyć warstwy agaru; delikatnie przebij warstwę agaru końcówką filtra P 200.Aby pobrać plamkę, ostrożnie wyjmij końcówkę z warstwy nakładki i przenieś korek aros do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 250 µL pożywki. Odpowiednia ilość wirusa zostanie przeniesiona niezależnie od tego, czy korek aros zostanie uwolniony z końcówki; wymieszaj zawartość probówki w vortexie, aby uzyskać dziesięciokrotne rozcieńczenie dla każdej próbki. Zachowaj część próbki do późniejszej amplifikacji żywego wirusa.Następnie wyizoluj RNA z pozostałej części próbki i przeprowadź R-T-P-C-R, aby zidentyfikować próbkę z plaką zawierającą pożądaną mutację. Zsekwencjonuj cDNA. Upewnij się, że nie wystąpiły dodatkowe mutacje.Następnie przygotuj większy zapas tego wirusa do wszystkich dalszych badań. W kolejnym kroku potwierdź oporność nadaną przez zidentyfikowaną mutację. Powtórz test mutagenny, stosując kilka różnych warunków mutagennych.Jeśli wariant jest odporny na wiele mutagenów, prawdopodobnie wykazuje zwiększoną wierność replikacji. Ponieważ mutacje zmieniające wierność mapują się na polimerazę, ważne jest potwierdzenie, że kinetyka replikacji nie uległa istotnej zmianie. Przed wyznaczeniem częstości mutacji należy zbadać replikację za pomocą co najmniej dwóch komplementarnych metod.Na przykład, oprócz metody badającej syntezę RNA, takiej jak ilościowy R-T-P-C-R lub northern blot, można przeprowadzić badanie produkcji wirusa, np. test plackowy lub TCID 50. Następnie, aby potwierdzić, że zidentyfikowana zmiana polimerazy nadająca oporność na mutagen wpływa na replikację, mierzy się częstotliwość mutacji wierności. Można to wykonać zarówno dla populacji wirusów żywych, jak i całkowitej.Aby określić częstotliwość mutacji w całkowitej populacji wirusa, obejmującej warianty żywe i nieżywe, należy wyekstrahować RNA i za pomocą RT-PCR amplyfikować region o długości od 800 do 1 200 nukleotydów z sekwencji kodującej, o której wiadomo, że posiada warianty genetyczne, np. kodującej białko strukturalne. Następnie należy wykonać klonowanie topo TA oczyszczonego produktu dla każdej badanej populacji wirusa. Wybierz 96 kolonii zidentyfikowanych jako posiadające pozytywny insert za pomocą selekcji błękitno-białej na płytkach pokrytych agarosem XGAL.Przeprowadź PCR pojedynczych kolonii, aby potwierdzić poprawność selekcji niebiesko-białej. Przy zastosowaniu powyższych warunków i rozmiarze fragmentu około 90% kolonii powinno być pozytywnych. W przypadku każdej pozytywnej białej kolonii, użyj wykałaczką, aby przenieść każdą kolonię do 1 ml pożywki LB w płytce 96-dołkowej.Płytki z kulturami bakterii inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C przy ciągłym wytrząsaniu. Następnego dnia izoluje się DNA, przygotowując mini-prepy w formacie 96-dołkowym, a następnie sekwenuje każdą płytkę, używając odpowiedniej liczby starterów, aby uzyskać maksymalne pokrycie sklonowanego segmentu.Dwie pary starterów o zasięgu 600 zasad powinny być wystarczające. Przeprowadź analizę sekwencji, wykorzystując sekwencję referencyjną lub konsensus dla każdej populacji oraz odpowiednie oprogramowanie do dopasowania, które pozwoli na łatwą identyfikację polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Skorzystaj z oprogramowania firmy DNAstar laser.Najpierw odrzuca się sekwencje słabej jakości, takie jak te z błędnym odczytem zasad na końcach lub o zbyt krótkiej długości. Następnie przeprowadza się dopasowanie pozostałych sekwencji. Identyfikuje się zakres nukleotydów pokrywany przez wszystkie sekwencje uwzględnione w analizie.Odrzuć klony, które nie są w pełni pokryte w tym regionie. Ze względów porównawczych niezbędne jest, aby ten sam region był w pełni pokryty. Zidentyfikuj i policz polimorfizmy pojedynczego nukleotydu, które różnią się od szczepu referencyjnego.Oblicz częstotliwość mutacji, dzieląc całkowitą liczbę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu przez całkowitą liczbę zsekwencjonowanych nukleotydów. Przedstaw tę wartość jako średnią liczbę mutacji na 10 000 zsekwencjonowanych nukleotydów. Jeśli ten sam polimorfizm pojedynczego nukleotydu pojawia się w dużej liczbie klonów, przedstaw dwie wartości: uwzględniającą oraz wykluczającą te powtórzone mutacje.Wyznacz rozkład mutacji. Stwórz listę rankingową liczby klonów w każdej populacji, które wykazują 0, 1, 2, 3 i tak dalej mutacji. Mutacje w regionie sekwencjonowanym opcjonalnie.Wykorzystaj zredagowane sekwencje do obliczenia wszystkich możliwych porównań par w obrębie próby w celu uzyskania średnich wartości różnorodności populacyjnej. Dostępnych jest tutaj kilka programów do dopasowania sekwencji. Program analizy genetyki ewolucyjnej molekularnej, znany również jako MEGA, jest używany do określenia optymalnych warunków selekcji pod kątem odporności RNA na mutageny.Nasze komórki poddano działaniu rosnących stężeń ribowiryny i zainfekowano wirusem Cox AKI B typu dzikiego z wielokrotnością infekcji 0,0 1 48 godzin po infekcji. Zebrano wirus potomne, a miana określono za pomocą TCID₅₀. Rysunek ten przedstawia procent komórek, które przeżyły terapię (oś x), określony na podstawie barwienia trypanowym błękitem 48 godzin po infekcji.Wyniki pokazują, że stężenia 100 i 200 mikromolar redukują miano wirusa o jeden do dwóch logarytmów, nie wpływając na żywotność komórek. Aby wyselekcjonować populacje oporne na mutagen, wirusa CHI ganga namnażano w komórkach hilar w obecności (szare słupki) lub braku (czarne słupki) 50 mikromolar ribovirinu; po każdym pasażu ilość potomstwa wirusa była określana klasyczną metodą tworzenia placków na komórkach BHK, co widać tutaj. Efekt mutagenny jest wyraźny podczas pierwszych pasaży, w których miano wirusa w grupie traktowanej spadło o dwa logarytmy.Tytuł stopniowo powrócił do normalnych poziomów nieleczonych. W pięciu populacjach traktowanych mutagenami nie zaobserwowano istotnych różnic w porównaniu z grupą nieleczoną, co sugeruje wyselekcjonowanie wariantów opornych. Rzeczywiście, sekwencjonowanie pozwoliło zidentyfikować unikalne mutacje w populacji wirusa poddanej leczeniu rybowiryną; aby potwierdzić szeroką oporność na mutageny RNA o różnej strukturze, wariant o wysokiej wierności A 3 72 V wirusa COA B trzy, pierwotnie wyizolowany podczas przesiewu, został przebadany pod kątem obniżonej wrażliwości na różne stężenia mutagenów RNA: RYBOWIRYNY, 5-fluorouracylu i 5-azacytydyny.Komórki potraktowano wskazanymi stężeniami rybowyrycyny i zainfekowano wirusem Cox AKI B typu dzikiego z wielokrotnością infekcji (MOI) 0,01. W 48 godzinach po infekcji zebrańo potomstwo wirusa i określono miana za pomocą metody TCID₅₀. Przedstawione tutaj miana typu dzikiego oraz wariantu A372 ukazano w funkcji stężenia mutagenu. Wariant A372 konsekwentnie wykazywał wyższe miana niż typ dziki.W ramach wszystkich warunków badanych w celu określenia kinetyki wzrostu jednokrokowego produkcji wirusa, nasze komórki zostały zainfekowane z multiplicity of infection wynoszącą 10 albo szczepem dzikim, wariantem o wysokiej wierności A 3 72 V, albo wariantem z defektem replikacyjnym CX 64 wirusa Cox AKI B three. W wskazanych punktach czasowych potęgowie wirusa zbierano z komórek i supernatantów poprzez zamrażanie i rozmrażanie, a następnie oznaczano mianrem TC ID 50. Wzrost wierności wariantu A 3 72 V nie wiąże się z obserwowalnym defektem replikacji w hodowli tkankowej. Wariant CX 64 wykazuje znaczne opóźnienie w kinetyce replikacji i osiąga maksymalne miana 1000 razy niższe niż w przypadku wirusa dzikiego.Stosując podejście opisane w tym filmie, każdy zsekwencjonowany klon pochodzi z unikalnego genomu w obrębie całkowitej populacji wirusa i niesie zatem unikalne mutacje. Na tej rysunku przedstawiono typowe dopasowanie sekwencji po usunięciu sekwencji słabej jakości i wizualizacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Obliczono całkowitą liczbę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w populacji oraz odnotowano liczbę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu występujących w każdym klonie.Na przykład klon podkreślony linią zawiera dwie unikalne mutacje, podczas gdy osiem innych klonów zawiera jedną unikalną mutację. Dane te służą do sporządzenia tabeli, takiej jak ta przedstawiona tutaj. Tabela ukazuje ranking rozkładu zsekwencjonowanych klonów według liczby mutacji.Statystyczne porównanie wartości rankingowych pozwala określić, czy jeden rozkład różni się znacząco od drugiego. Dla łatwiejszej interpretacji dane numeryczne uzyskane z analizy sekwencji i analizy statystycznej mogą być przedstawione w formie wykresu lub histogramu. Jak pokazano tutaj, wirus A 3 72 V generuje mniej mutacji niż typ dziki i wykazuje znacznie niższą częstotliwość mutacji przy wartości P mniejszej niż 0,01.Ta sama populacja wirusa ganga kurczaka wykazuje podobne częstotliwości mutacji, niezależnie od tego, czy do ekstrakcji RNA użyto zapasu wirusa, czy jego rozcieńczenia 10⁵-krotnego. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić biochemiczne testy in vitro lub badania krystalizacyjne, aby lepiej zrozumieć mechanistyczne i strukturalne podstawy wierności tej wersji polimerazy.Po tym osiągnięciu technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie biologii drogę do analizy korelacji między różnorodnością genetyczną a przymiotami wirusa (fitness) in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zwiększyć szanse na wyizolowanie wariantów wierności replikacji wirusa RNA oraz jak wykorzystać częstotliwość mutacji do zidentyfikowania tych różnic w wierności.

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja wariantów wierności wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusów

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Ten protokół opisuje szybką i szeroko stosowaną metodę bezstronnego sekwencjonowania RNA próbek wirusa z ludzkich izolatów klinicznych.

Bezstronne, głębokie sekwencjonowanie wirusów RNA z próbek klinicznych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, jeden do pomiaru specyficznego tempa wzrostu, a drugi do zdolności wiązania komórek rotawirusa za pomocą testu płytki nazębnej i RT-qPCR. Protokoły te są dostępne w celu potwierdzenia różnic w fenotypach między szczepami rotawirusa.

Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa

Dwuniciowe RNA wytwarzane podczas replikacji wirusa RNA mogą być rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzorce, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wirusów RNA o ujemnym znaczeniu interakcja między niskim poziomem dsRNA a PRR pozostaje niejasna. Opracowaliśmy metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dsRNA i PRR arenawirusa w poszczególnych komórkach.

Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Poznaj metodę izolacji wariantów wierności polimeraz wirusów RNA i charakterystykę częstości mutacji. Technika ta pozwala identyfikować mutacje wpływające na błędy replikacji wirusowej.

Izolacja wariantów wierności replikacji wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa

Przeglądaj więcej filmów