Izolacja wariantów wierności replikacji wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa

Wirusy RNA wykorzystują kodowane wirusowo polimerazy RNA do replikacji swoich genomów. Polimerazy te charakteryzują się naturalnie wyższym wskaźnikiem błędów, co pozwala wirusowi na szybką adaptację i ewolucję. W niniejszym filmie przedstawiono zoptymalizowaną metodę przesiewową służącą do identyfikacji wirusów z mutacjami w polimerazie RNA, które wpływają na wskaźnik błędów lub wierność replikacji.

W pierwszej kolejności do komórek gospodarza wirusa stosuje się mutageny, aby określić maksymalne stężenie mutagenu, które można zastosować bez zabijania komórek lub hamowania wirusa. Po ustaleniu optymalnych warunków wirusa pasażuje się pod presją selekcyjną mutagenów RNA. Następnie populację oporną na mutagen poddaje się sekwencjonowaniu w celu zidentyfikowania odpowiedzialnej za to mutacji.

Następnie izoluje się mutant odporny na mutagen. Monitorowana jest kinetyka replikacji, a wyniki wykazują wzrost lub spadek wierności polimerazy. Towarzyszy temu szeroka odporność na mutageny RNA oraz zmiany w częstotliwości mutacji w populacji wirusa.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza wierności biochemicznej z użyciem oczyszczonych polimeraz, jest fakt, że techniki te są aktualne dla każdego wirusa RNA, który może być hodowany w kulturach tkankowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, takie jak rola szybkości polimerazy w adaptacji i ewolucji wirusa. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ stosowane przez nich presje selekcyjne są albo zbyt silne, albo zbyt słabe, a wielkość analizowanej próbki sekwencji regionu oraz liczba klonów nie zostały zoptymalizowane pod kątem mocy statystycznej.

Rozpocznij ten eksperyment od określenia zakresu stężeń mutagenów, które mogą być stosowane w kolejnych badaniach bez powodowania śmierci komórek. Odsuń medium z sześciostudzienkowych płytek zawierających subkonfluencyjne monowarstwy komórek wątrobowych. Następnie dodaj dwa mililitry medium uzupełnionego o mutagen; w tym przypadku zastosowano mutageny: rybowcydynę, 5-fluorouracyl, 5-azacytydynę, chlorek magnezu oraz chlorek manganu.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla. Następnie co 24 godziny przez kolejne dwa do siedmiu dni wykorzystaj jedną płytkę z komórkami do oceny żywotności metodą wykluczania błękitu trypanu. Używając komory countingowej, oblicz procent żywych komórek dla każdego stężenia mutagenu, wliczając w to warunki kontrolne bez traktowania, które skutkują śmiercią mniej niż 50% komórek w punkcie końcowym infekcji.

Gdy osiągnięte zostaną idealne maksymalne miana, kolejnym krokiem procedury jest określenie stężenia mutagenu, które wywrze optymalną presję selekcyjną, nie powodując jednocześnie nadmiernej mutacji populacji przy odpowiednich stężeniachach. Każdy genom zostaje poddany mutacji w co najmniej jednej lub dwóch pozycjach. Mutagen wygeneruje zatem mutację oporności, która następnie zostanie wyselekcjonowana w kolejnych pasażach.

Jeśli wprowadzonych zostanie zbyt wiele mutacji, mutanty posiadające mutację oporności same staną się letalne. Mutagen utrudnia ich izolację w płytkach 6-dołkowych zasiaianych komórkami. Do naszych komórek stosuje się 2 ml pożywki uzupełnionej mutagenem, używając tego samego zakresu stężeń co wcześniej, z wyłączeniem stężeń, które spowodowały śmierć ponad 50% komórek.

Inkubować przez dwie godziny, aby umożliwić pobranie mutagenu, a następnie po inkubacji odessać pożywkę i zainfekować wirusem przy niskiej wielokrotności infekcji w 200 µL. Inkubować od 15 do 60 minut, aby wirus mógł zainfekować komórki, regularnie kołysząc płytką, aby zapewnić pokrycie monowarstwy komórkowej przez inokulum. Odessać inokulum wirusowe i przemyć dwukrotnie 2 mL PBS, aby usunąć jak największą ilość inokulum.

Następnie do każdej studzienki dodaje się pożywkę z mutagenem i inkubuje komórki przez okres odpowiadający od trzech do sześciu cykli replikacyjnych, zazwyczaj od dwóch do siedmiu dni. Z każdej studzienki pozyskuje się wirusa, a następnie wykonuje standardowy test plackowy lub rozcieńczenie ograniczające, aby na podstawie obliczonych mian wyznaczyć efekt przeciwwirusowy w odniesieniu do miana wirusa. Określa się stężenie mutagenu, które obniża miana wirusa w porównaniu z nieleczoną kontrolą infekcji o 0,5 do dwóch logarytmów i jednocześnie nie wykazuje wysokiej toksyczności wobec komórek.

W idealnym przypadku toksyczność powinna wynosić mniej niż 50%, aby wyizolować warianty oporne na mutageny. Należy rozpocząć od pasażowania wirusa w komórkach HeLa z optymalnym stężeniem każdego mutagenu; wirus może wymagać do 30 pasażów, przy czym w każdym pasażu należy oznaczyć miano wirusa i powtórzyć infekcję oraz inkubację z mutagenem, tak jak pokazano tutaj. Miana wirusa w próbkach traktowanych mutagenem powinny spaść podczas pierwszych kilku pasaży w porównaniu z pierwotnym mianem wirusa oraz mianami wirusa w kontroli nietraktowanej. Gdy miana wirusa dla danej serii osiągną tę samą wartość co miana w kontroli nietraktowanej, sugeruje to powstanie oporności.

Wyizoluj wirusowe RNA do sekwencjonowania, używając starterów amplifikujących geny polimerazy lub replikazy interesującego wirusa. Uzyskaj cDNA genomu wirusowego metodą RT-PCR, a następnie przeprowadź sekwencjonowanie DNA. Po uzyskaniu informacji o sekwencji.

Użyj oprogramowania do dopasowania sekwencji, aby zestawić uzyskane sekwencje z konsensusem referencyjnym i zidentyfikować nowe mutacje punktowe. Dodatkowo sprawdź chromatogramy pod kątem mniejszościowych pików, które mogły zostać pominięte przez oprogramowanie do dopasowania. Mutant reprezentujący od 20 do 30% całkowitej populacji nadal będzie widoczny jako pik, lecz zbyt mały, by zostać zidentyfikowanym jako mieszany nukleotyd podczas standardowej analizy sekwencji. Aby zidentyfikować interesującą mutację, szukaj polimorfizmów pojedynczego nukleotydu, które występują wyłącznie w populacji poddanej mutagenezie w porównaniu z nieleczoną kontrolą z tego samego pasażu, jak pokazano tutaj. Po zidentyfikowaniu mutacji wariant oporny musi zostać zregenerowany z zakaźnego cDNA lub wyizolowany w hodowli tkankowej, a następnie należy potwierdzić fenotyp oporności.

W niniejszym kroku przeprowadzamy test plackowy w celu wyizolowania zidentyfikowanych mutantów. Przygotowujemy rozcieńczenia seryjne próbki odpornej na azot i nanosimy je na monowarstwy komórek w płytkach sześciodołkowych w celu wykonania testu plackowego po inkubacji przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2. Warstwę agarozy nakładamy od dwóch do pięciu dni po infekcji.

Plamy powinny być wyraźnie widoczne. W idealnym przypadku na jednej z płytek powinno pojawić się od 10 do 50 dobrze oddzielonych plam. Zaznacz miejsce występowania plam na płytce kropką za pomocą markera, uważając, aby nie przesunąć ani nie z desloczyć warstwy agaru; delikatnie przebij warstwę agaru końcówką filtra P 200.

Aby pobrać plamkę, ostrożnie wyjmij końcówkę z warstwy nakładki i przenieś korek aros do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 250 µL pożywki. Odpowiednia ilość wirusa zostanie przeniesiona niezależnie od tego, czy korek aros zostanie uwolniony z końcówki; wymieszaj zawartość probówki w vortexie, aby uzyskać dziesięciokrotne rozcieńczenie dla każdej próbki. Zachowaj część próbki do późniejszej amplifikacji żywego wirusa.

Następnie wyizoluj RNA z pozostałej części próbki i przeprowadź R-T-P-C-R, aby zidentyfikować próbkę z plaką zawierającą pożądaną mutację. Zsekwencjonuj cDNA. Upewnij się, że nie wystąpiły dodatkowe mutacje.

Następnie przygotuj większy zapas tego wirusa do wszystkich dalszych badań. W kolejnym kroku potwierdź oporność nadaną przez zidentyfikowaną mutację. Powtórz test mutagenny, stosując kilka różnych warunków mutagennych.

Jeśli wariant jest odporny na wiele mutagenów, prawdopodobnie wykazuje zwiększoną wierność replikacji. Ponieważ mutacje zmieniające wierność mapują się na polimerazę, ważne jest potwierdzenie, że kinetyka replikacji nie uległa istotnej zmianie. Przed wyznaczeniem częstości mutacji należy zbadać replikację za pomocą co najmniej dwóch komplementarnych metod.

Na przykład, oprócz metody badającej syntezę RNA, takiej jak ilościowy R-T-P-C-R lub northern blot, można przeprowadzić badanie produkcji wirusa, np. test plackowy lub TCID 50. Następnie, aby potwierdzić, że zidentyfikowana zmiana polimerazy nadająca oporność na mutagen wpływa na replikację, mierzy się częstotliwość mutacji wierności. Można to wykonać zarówno dla populacji wirusów żywych, jak i całkowitej.

Aby określić częstotliwość mutacji w całkowitej populacji wirusa, obejmującej warianty żywe i nieżywe, należy wyekstrahować RNA i za pomocą RT-PCR amplyfikować region o długości od 800 do 1 200 nukleotydów z sekwencji kodującej, o której wiadomo, że posiada warianty genetyczne, np. kodującej białko strukturalne. Następnie należy wykonać klonowanie topo TA oczyszczonego produktu dla każdej badanej populacji wirusa. Wybierz 96 kolonii zidentyfikowanych jako posiadające pozytywny insert za pomocą selekcji błękitno-białej na płytkach pokrytych agarosem XGAL.

Przeprowadź PCR pojedynczych kolonii, aby potwierdzić poprawność selekcji niebiesko-białej. Przy zastosowaniu powyższych warunków i rozmiarze fragmentu około 90% kolonii powinno być pozytywnych. W przypadku każdej pozytywnej białej kolonii, użyj wykałaczką, aby przenieść każdą kolonię do 1 ml pożywki LB w płytce 96-dołkowej.

Płytki z kulturami bakterii inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C przy ciągłym wytrząsaniu. Następnego dnia izoluje się DNA, przygotowując mini-prepy w formacie 96-dołkowym, a następnie sekwenuje każdą płytkę, używając odpowiedniej liczby starterów, aby uzyskać maksymalne pokrycie sklonowanego segmentu.

Dwie pary starterów o zasięgu 600 zasad powinny być wystarczające. Przeprowadź analizę sekwencji, wykorzystując sekwencję referencyjną lub konsensus dla każdej populacji oraz odpowiednie oprogramowanie do dopasowania, które pozwoli na łatwą identyfikację polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Skorzystaj z oprogramowania firmy DNAstar laser.

Najpierw odrzuca się sekwencje słabej jakości, takie jak te z błędnym odczytem zasad na końcach lub o zbyt krótkiej długości. Następnie przeprowadza się dopasowanie pozostałych sekwencji. Identyfikuje się zakres nukleotydów pokrywany przez wszystkie sekwencje uwzględnione w analizie.

Odrzuć klony, które nie są w pełni pokryte w tym regionie. Ze względów porównawczych niezbędne jest, aby ten sam region był w pełni pokryty. Zidentyfikuj i policz polimorfizmy pojedynczego nukleotydu, które różnią się od szczepu referencyjnego.

Oblicz częstotliwość mutacji, dzieląc całkowitą liczbę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu przez całkowitą liczbę zsekwencjonowanych nukleotydów. Przedstaw tę wartość jako średnią liczbę mutacji na 10 000 zsekwencjonowanych nukleotydów. Jeśli ten sam polimorfizm pojedynczego nukleotydu pojawia się w dużej liczbie klonów, przedstaw dwie wartości: uwzględniającą oraz wykluczającą te powtórzone mutacje.

Wyznacz rozkład mutacji. Stwórz listę rankingową liczby klonów w każdej populacji, które wykazują 0, 1, 2, 3 i tak dalej mutacji. Mutacje w regionie sekwencjonowanym opcjonalnie.

Wykorzystaj zredagowane sekwencje do obliczenia wszystkich możliwych porównań par w obrębie próby w celu uzyskania średnich wartości różnorodności populacyjnej. Dostępnych jest tutaj kilka programów do dopasowania sekwencji. Program analizy genetyki ewolucyjnej molekularnej, znany również jako MEGA, jest używany do określenia optymalnych warunków selekcji pod kątem odporności RNA na mutageny.

Nasze komórki poddano działaniu rosnących stężeń ribowiryny i zainfekowano wirusem Cox AKI B typu dzikiego z wielokrotnością infekcji 0,0 1 48 godzin po infekcji. Zebrano wirus potomne, a miana określono za pomocą TCID₅₀. Rysunek ten przedstawia procent komórek, które przeżyły terapię (oś x), określony na podstawie barwienia trypanowym błękitem 48 godzin po infekcji.

Wyniki pokazują, że stężenia 100 i 200 mikromolar redukują miano wirusa o jeden do dwóch logarytmów, nie wpływając na żywotność komórek. Aby wyselekcjonować populacje oporne na mutagen, wirusa CHI ganga namnażano w komórkach hilar w obecności (szare słupki) lub braku (czarne słupki) 50 mikromolar ribovirinu; po każdym pasażu ilość potomstwa wirusa była określana klasyczną metodą tworzenia placków na komórkach BHK, co widać tutaj. Efekt mutagenny jest wyraźny podczas pierwszych pasaży, w których miano wirusa w grupie traktowanej spadło o dwa logarytmy.

Tytuł stopniowo powrócił do normalnych poziomów nieleczonych. W pięciu populacjach traktowanych mutagenami nie zaobserwowano istotnych różnic w porównaniu z grupą nieleczoną, co sugeruje wyselekcjonowanie wariantów opornych. Rzeczywiście, sekwencjonowanie pozwoliło zidentyfikować unikalne mutacje w populacji wirusa poddanej leczeniu rybowiryną; aby potwierdzić szeroką oporność na mutageny RNA o różnej strukturze, wariant o wysokiej wierności A 3 72 V wirusa COA B trzy, pierwotnie wyizolowany podczas przesiewu, został przebadany pod kątem obniżonej wrażliwości na różne stężenia mutagenów RNA: RYBOWIRYNY, 5-fluorouracylu i 5-azacytydyny.

Komórki potraktowano wskazanymi stężeniami rybowyrycyny i zainfekowano wirusem Cox AKI B typu dzikiego z wielokrotnością infekcji (MOI) 0,01. W 48 godzinach po infekcji zebrańo potomstwo wirusa i określono miana za pomocą metody TCID₅₀. Przedstawione tutaj miana typu dzikiego oraz wariantu A372 ukazano w funkcji stężenia mutagenu. Wariant A372 konsekwentnie wykazywał wyższe miana niż typ dziki.

W ramach wszystkich warunków badanych w celu określenia kinetyki wzrostu jednokrokowego produkcji wirusa, nasze komórki zostały zainfekowane z multiplicity of infection wynoszącą 10 albo szczepem dzikim, wariantem o wysokiej wierności A 3 72 V, albo wariantem z defektem replikacyjnym CX 64 wirusa Cox AKI B three. W wskazanych punktach czasowych potęgowie wirusa zbierano z komórek i supernatantów poprzez zamrażanie i rozmrażanie, a następnie oznaczano mianrem TC ID 50. Wzrost wierności wariantu A 3 72 V nie wiąże się z obserwowalnym defektem replikacji w hodowli tkankowej. Wariant CX 64 wykazuje znaczne opóźnienie w kinetyce replikacji i osiąga maksymalne miana 1000 razy niższe niż w przypadku wirusa dzikiego.

Stosując podejście opisane w tym filmie, każdy zsekwencjonowany klon pochodzi z unikalnego genomu w obrębie całkowitej populacji wirusa i niesie zatem unikalne mutacje. Na tej rysunku przedstawiono typowe dopasowanie sekwencji po usunięciu sekwencji słabej jakości i wizualizacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Obliczono całkowitą liczbę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w populacji oraz odnotowano liczbę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu występujących w każdym klonie.

Na przykład klon podkreślony linią zawiera dwie unikalne mutacje, podczas gdy osiem innych klonów zawiera jedną unikalną mutację. Dane te służą do sporządzenia tabeli, takiej jak ta przedstawiona tutaj. Tabela ukazuje ranking rozkładu zsekwencjonowanych klonów według liczby mutacji.

Statystyczne porównanie wartości rankingowych pozwala określić, czy jeden rozkład różni się znacząco od drugiego. Dla łatwiejszej interpretacji dane numeryczne uzyskane z analizy sekwencji i analizy statystycznej mogą być przedstawione w formie wykresu lub histogramu. Jak pokazano tutaj, wirus A 3 72 V generuje mniej mutacji niż typ dziki i wykazuje znacznie niższą częstotliwość mutacji przy wartości P mniejszej niż 0,01.

Ta sama populacja wirusa ganga kurczaka wykazuje podobne częstotliwości mutacji, niezależnie od tego, czy do ekstrakcji RNA użyto zapasu wirusa, czy jego rozcieńczenia 10⁵-krotnego. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić biochemiczne testy in vitro lub badania krystalizacyjne, aby lepiej zrozumieć mechanistyczne i strukturalne podstawy wierności tej wersji polimerazy.

Po tym osiągnięciu technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie biologii drogę do analizy korelacji między różnorodnością genetyczną a przymiotami wirusa (fitness) in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zwiększyć szanse na wyizolowanie wariantów wierności replikacji wirusa RNA oraz jak wykorzystać częstotliwość mutacji do zidentyfikowania tych różnic w wierności.