Name: Analiza biofilmu jamy ustnej ekspanderów podniebiennych metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in-situ i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę analizy biofilmu jamy ustnej z ekspanderów podniebiennych przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i konfokalnej mikroskopii laserowej. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie struktury i składu bakteryjnych wspólnot biofilmowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez Hygiene Fonds Uniwersytetu Medycznego w Grazie. Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę. Zgoda instytucjonalna na protokół badania została uzyskana z Uniwersytetu Medycznego w Grazie.

1. Pobieranie próbek
<ol>
 <li>Usuń stałe rozszerzacze podniebienne po 4 miesiącach użytkowania w jamie ustnej. Przed ich usunięciem zastosuj system NOLA Dry Field System w celu izolacji aparatów (ryciny 1 i 2).</li>
 <li>Użyj wysterylizowanych szczypiec, rękawiczek i tacek, aby usunąć rozszerzacze bez wprowadzania zanieczyszczeń (ryciny 3 i 4).</li>
 <li>Przechowuj obiekty w fiolkach Sarstedt 120 ml w temperaturze -20°C. Przenieś je do laboratorium w lodu i poddaj obróbce w ciągu 24 godzin.</li>
</ol>
2. Fixacja biofilmu
<ol>
 <li>Zeskrobać płatki biofilmu za pomocą sterylnego skalpela lub zebrać fragmenty sterylną pęsetą.</li>
 <li>Dodać lodowaty 4% roztwór PFA, aż próbka zostanie całkowicie zakryta.</li>
 <li>Inkubować mieszaninę w temperaturze +4°C (nie zamrażać) przez okres od 3 do 12 godzin. Dłuższy czas fiksacji lub wyższa temperatura fiksacji mogą zmniejszyć przepuszczalność osłonek komórkowych komórek gram-ujemnych dla sond oligonukleotydowych.</li>
 <li>Usunąć roztwór PFA i przemyć lodowatym 1X PBS. Powtórzyć ten krok 2-3 razy, aby usunąć resztki PFA.</li>
 <li>Resuspendować próbkę w 1 obj. lodowatego 1X PBS i dodać 1 obj. lodowatego 96% (v/v) etanolu.</li>
 <li>Przechowywać próbkę w temperaturze -20°C. Próbki ufiksowane zgodnie z tym protokołem mogą być przechowywane od kilku miesięcy do kilku lat.</li>
</ol>
3. Odwodnienie utrwalonych próbek
<ol>
 <li>Nanieść 5-30 μl materiału próbki utrwalonej w PFA na szkiełko przedmiotowe.</li>
 <li>Suszyć w temperaturze 46°C przez około 15 min lub w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas. Odmrozić lizozym oraz formamid.</li>
 <li>Dodać 250 μl lizozymu (1mg/ml) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min, aby ułatwić penetrację sond do wnętrza komórek poprzez częściowe zniszczenie ścian komórkowych.</li>
 <li>Zanurzać szkiełko kolejno w etanolu o stężeniach 50%, 80% i 96% (v/v) na 3 min każde. Efekt odwadniania wynikający z serii stężeń etanolu spowoduje dezintegrację błon komórkowych.</li>
 <li>Suszyć szkiełka w temperaturze 46°C przez 10 min.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja in-situ
<ol>
 <li>Przygotować 1 ml świeżego buforu do hybrydyzacji (stężenia podano w Tabeli 1). Stężenia formamidu zastosowane w niniejszym badaniu: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) lub 45% (LGCmix).</li>
 <li>Odmrozić roztwory sond oligonukleotydowych. Odmrożone sondy należy przechowywać w lodzie i chronić przed światłem.</li>
 <li>Dodać 2 μl każdej sondy do 200 μl buforu do hybrydyzacji, dokładnie wymieszać i nanieść mieszaninę na odwodnioną próbkę na szkiełku przedmiotowym.</li>
 <li>Umieścić kawałek ręcznika papierowego w kwadratowej szalce Petriego i wlać pozostały bufor do hybrydyzacji na ręcznik.</li>
 <li>Natychmiast umieścić szkiełko poziomo w szalce i zamknąć naczynie. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 46°C przez 1-5 godzin (w większości przypadków wystarczy 90 min). Szalka pełni funkcję komory wilgotnościowej, zapobiegając odparowywaniu roztworu do hybrydyzacji ze szkiełka. W szczególności odparowanie formamidu może prowadzić do nieswoistego wiązania sond z komórkami niebędącymi celem.</li>
 <li>Przygotować 50 ml buforu do płukania (stężenia podano w Tabeli 2). Bufor do płukania należy przygotować w probówce 50 ml i podgrzać do 48°C w łaźni wodnej. Etap płukania przeprowadza się w temperaturze 48°C.</li>
 <li>Wyjąć szalkę ze szkiełkiem z inkubatora do hybrydyzacji. Natychmiast spłukać bufor do hybrydyzacji niewielką objętością uprzednio podgrzanego buforu do płukania, a następnie przenieść szkiełko do pozostałego buforu do płukania.</li>
 <li>Umieścić probówkę zawierającą bufor do płukania i szkiełko z powrotem w łaźni wodnej i inkubować w 48°C przez 10-15 min.</li>
 <li>Wyjąć szkiełko z probówki i zanurzyć w lodowatej ddH2O na 2-3 sekundy, aby usunąć pozostałości buforu do płukania.</li>
 <li>Osuszyć szkiełko na powietrzu tak szybko, jak to możliwe (zaleca się użycie sprężonego powietrza). Szybkie suszenie ograniczy dysocjację sond.</li>
 <li>Wysuszone szkiełka można przechowywać w ciemności w temperaturze -20°C przez kilka tygodni bez znacznej utraty sygnału fluorescencji nadanego przez sondy.</li>
</ol>
5. Mikroskopia
<ol>
 <li>Po przeprowadzeniu FISH i przemyciu, nanieś dwie krople środka zapobiegającego blaknięciu (antifadent) w pobliżu lewego i prawego końca szkiełka (przekroje mrożone należy uprzednio ogrzać do temperatury pokojowej przed tym krokiem).</li>
 <li>Nałóż na wierzch szkiełko nakrywkowe i poczekaj, aż antifadent rozprzestrzeni się na całym preparacie. Należy pamiętać, że nadmierna ilość antifadentu może spowodować rozmycie obrazu mikroskopowego.</li>
 <li>Próbki należy obserwować pod konfokalnym skaningowym mikroskopem laserowym wyposażonym w odpowiednie filtry lub lasery. W tej procedurze wykorzystano jednostkę Leica TCS (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Dane można analizować za pomocą oprogramowania takiego jak IMARIS lub AMIRA.</li>
 <li>Szkiełka z naniesionym antifadentem można przechowywać w temperaturze +4°C (nie zamrażać) do 7 dni, zanim fluorescencja nadana przez sondę zacznie słabnąć. Alternatywnie, antifadent można usunąć za pomocą ddH2O, a wysuszone szkiełka przechowywać w temperaturze -20°C przez dłuższy czas.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Zeskrobanie biofilmu z utrwalonych aparatów ortodontycznych (Rycina 5) pozwala na uzyskanie odpowiednich płatków (Rycina 6), które mogą zostać poddane hybrydyzacji bezpośrednio na powlekanych szkiełkach przedmiotowych do mikroskopii. W ten sposób można zidentyfikować różne grupy bakterii orobiomu w ich naturalnym środowisku trójwymiarowym poprzez znakowanie bakteryjnego rRNA za pomocą specyficznych sond z różnymi znacznikami (Ryciny 7 i 8). Na Rycini 7 biofilm został zabarwiony EUBmix (zielony, wszystkie bakterie) oraz LGCmix (żółty, Firmicutes). Firmicutes widoczne są na zielono, ponieważ zostały zabarwione na żółto i niebiesko. Na Rycini 8 biofilm został zabarwiony EUBmix (czerwony, wszystkie bakterie), Bac303 (niebieski, Bacteroidetes) oraz POGI (żółty, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis jest przedstawiona w kolorze żółtawo-białym, ponieważ wszystkie trzy sondy wiążą się z jej DNA, a nałożenie się kolorów daje biały sygnał. Można również zidentyfikować różnice morfologiczne między grupami bakterii (Ryciny 9 i 10). Duże skupiska bakterii kokoidalnych pokazano na Rycini 9, gdzie barwienie przeprowadzono z użyciem EUBmix (zielony, wszystkie bakterie). Różne kształty bakterii jamy ustnej zwizualizowano na Rycini 10, gdzie bakterie kokoidalne i nitkowate można rozróżnić dzięki barwieniu EUBmix (czerwony). Ponadto typową strukturę biofilmu przypominającą grzyba można opracować za pomocą modelowania 3D danych z CLSM (Ryciny 11 i 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film z modelowania 3D.</a>
<img alt="Aparat ortodontyczny do rozszerzania górnych zębów; wyrównywanie zębów i korekcja zgryzu." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Stały ekspander podniebienny in situ.
<img alt="Aparat do ekspansji ortodontycznej; anatomia zębów; widok wewnątrzustny; struktura podniebienia; odstępy między zębami." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. System suchego pola Nola.
<img alt="Zestaw do sterylizacji narzędzi chirurgicznych, obejmujący instrumenty, tackę i opakowanie z rękawiczkami, do procedur medycznych." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Sterylne szczypce, rękawiczki i tacka.
<img alt="Schemat mechanizmu aparatu stomatologicznego ilustrujący ortodontyczne poszerzanie szczęki." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Usunięty ekspander.
<img alt="Przycinanie modelu stomatologicznego, badanie ortodontyczne; dłonie w rękawiczkach, precyzyjne narzędzie tnące, pokaz edukacyjny." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Zeskrobywanie biofilmu za pomocą sterylnego skalpela.
<img alt="Płyta do chromatografii cienkowarstwowej, proces chromatografii, plamki wskazujące wyniki rozdziału." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Płatki żywicy bezpośrednio hybrydyzowane na powlekanych szkiełkach przedmiotowych.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, struktura komórkowa, interakcja mikrobiologiczna, skala 20μm." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Obraz CLSM: różnicowanie specyficznej grupy bakterii. Nakładka 2D danych z serii obrazów 3D CLSM. Biofilm zabarwiony EUBmix (zielony, wszystkie bakterie) i LGCmix (żółty, Firmicutes).
<img alt="Wynik mikroskopii fluorescencyjnej, wizualizacja struktury komórkowej z czerwonymi i niebieskimi markerami białkowymi." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Obraz CLSM: różnicowanie specyficznej grupy bakteryjnej. Nakładka 2D danych ze stosu 3D CLSM. Biofilm zabarwiony EUBmix (czerwony, wszystkie bakterie), Bac303 (niebieski, Bacteroidetes) i POGI (żółty, Porphyromonas gingivalis).
<img alt="Obraz mikroskopowy białka fluorescencyjnego zielonego, podkreślający rozkład białka w hodowli komórkowej." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Obraz CLSM: różnicowanie specyficznych morfologii. Nakładka 2D danych ze stosu 3D CLSM. Biofilm barwiony EUBmix (zielony, wszystkie bakterie). Duże skupiska bakterii kokoidalnych (strzałki).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, rozkład czerwonych fluorescencyjnych bakterii, pasek skali 20 μm, badanie biofilmu." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10. Obrazy CLSM: rozróżnienie specyficznych morfologii. Nakładka 2D danych ze stosu 3D CLSM. Biofilm barwiony EUBmix (kolor czerwony, wszystkie bakterie). Można rozróżnić bakterie kokoidalne (strzałka poniżej) oraz nitkowate (strzałka powyżej).
<img alt="Obraz 3D z mikroskopii konfokalnej, sekcjonowanie optyczne, wizualizacja struktury komórkowej, analiza fluorescencyjna." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 11"> 
Rysunek 11. Struktura grzyba, widoki 3D od dołu. Stosy płatków biofilmu (zeskrobanych z powierzchni urządzenia ortodontycznego), barwione EUBmix i przetworzone w programie IMARIS (obraz CLSM).
<img alt="Obraz 3D z mikroskopii konfokalnej, sekcjonowanie optyczne, wizualizacja struktury komórkowej, analiza fluorescencji." src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 11"> 
Rysunek 12. Struktura grzyba, widok z boku 3D. Stosy płatków biofilmu (zeskrobane z powierzchni aparatu ortodontycznego) przetworzone w programie IMARIS (obraz CLSM).
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="4">Bufor do hybrydyzacji (200 μl)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stężenie formamidowe</td>
 <td>10%</td>
 <td>20%</td>
 <td>45%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>36</td>
 <td>36</td>
 <td>36</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris-HCl</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2% SDS</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FA</td>
 <td>20</td>
 <td>40</td>
 <td>90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O</td>
 <td>138</td>
 <td>118</td>
 <td>68</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dowolna sonda FISH</td>
 <td>2</td>
 <td>2</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Składniki buforu do hybrydyzacji (stężenia w μl).
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="4">Bufor piorący (50 ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stężenie formamidyny</td>
 <td>10%</td>
 <td>20%</td>
 <td>45%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>4500</td>
 <td>2150</td>
 <td>300</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris-HCl</td>
 <td>1000</td>
 <td>1000</td>
 <td>1000</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0,5 M EDTA</td>
 <td>0</td>
 <td>500</td>
 <td>500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O2O</td>
 <td>44 500</td>
 <td>46 350</td>
 <td>48 200</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Składniki buforu płuczącego (stężenia w μl).
Film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a>

<ol><li>Sunde, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+bacteria+in+periapical+lesions+of+asymptomatic+root-filled+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth.</a> Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).</li>
<li>Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marine+fireworm+Hermodice+carunculata+is+a+winter+reservoir+and+spring-summer+vector+for+the+coral-bleaching+pathogen+Vibrio+shiloi%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi.</a> Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+among+oral+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Communication among oral bacteria.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).</li>
<li>Zijnge, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+biofilm+architecture+on+natural+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oral biofilm architecture on natural teeth.</a> PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fluorescent+in+situ+hybridization+for+the+specific+detection+and+quantification+of+oral+streptococci+in+dental+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque.</a> J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).</li>
<li>Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+in+dental+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions in dental biofilm development.</a> J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).</li>
<li>Jung, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+initial+bacterial+colonization+on+dentine+and+enamel+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ.</a> J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).</li>
<li>Al-Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+enamel+in+situ+investigated+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization.</a> J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).</li>
<li>Bryers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Medical biofilms.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).</li>
<li>Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+the+bacterial+community+associated+with+the+reindeer+lichen+Cladonia+arbuscula+reveals+predominance+of+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).</li>
<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+biofilm+formation+and+the+effects+of+antimicrobial+agents+on+orthodontic+bonding+materials+in+a+parallel+plate+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Orthod%22%5BJournal%5D)">Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber.</a> Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).</li>
<li>Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes%3A+new+features+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007.</a> Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).</li>
<li>Diaz, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).</li>
<li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+and+successions+during+plaque+development%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions and successions during plaque development.</a> Periodontology. 42, 47-79 (2000).</li>
<li>Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+multispecies+biofilm+development+and+the+key+role+of+cell-cell+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).</li>
<li>Chalmers, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+monitoring+the+development+of+bacterial+biofilms+in+human+periodontal+pockets%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets.</a> FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).</li>
<li>Moter, A., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms.</a> J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół stanowi wysoce efektywne podejście do barwienia biofilmów pobranych z materiałów twardych. Pobieranie próbek i hybrydyzacja są najbardziej krytycznymi etapami. Podczas pobierania należy zadbać o to, aby zebrane plastry miały odpowiednią grubość, co zapewni zachowanie nienaruszonej struktury biofilmu. Podczas hybrydyzacji niezbędne jest unikanie nadmiernych wahań temperatury, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu lub utracie wiązania fluorescencyjnie znakowanych sond. Niniejszy protokół FISH jest elegancką metodą barwienia naturalnych, heterogenicznych biofilmów bezpośrednio na szkiełkach przedmiotowych, bez zaburzania ich składu. Szkiełka mogą być natychmiast wykorzystane do mikroskopii, bez konieczności ponownego przenoszenia próbki. W ten sposób uzyskano usprawnienie w stosunku do barwienia w probówkach dzięki zastosowaniu mniejszej siły ścinającej oddziałującej na biofilm. W ten sposób można przygotować i badać plastry o grubości &gt; 50 μm.

analiza biofilmu jamy ustnej w aparatach do rozszerzania podniebienia z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej i konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Konfokalna mikroskopia laserowa (CLSM) naturalnego, heterogennego biofilmu jest obecnie wspierana przez szeroki zakres technik barwienia, z których jedną jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH).1,2 Przeprowadziliśmy badanie pilotażowe, w którym próbki biofilmu jamy ustnej pobrane z aparatów ortodontycznych (rozszerzaczy podniebnych) zostały zabarwione metodą FISH, a celem była ocena trójwymiarowej organizacji naturalnego biofilmu i akumulacji płytki.3,4 FISH stwarza możliwość barwienia komórek w ich rodzinnym środowisku biofilmu przy użyciu sond znakowanych fluorescencyjnie, celujących w 16S rRNA.4-7,19 W porównaniu z alternatywnymi technikami, takimi jak znakowanie immunofluorescencyjne, jest to niedroga, precyzyjna i prosta technika znakowania służąca do badania różnych grup bakterii w mieszanych konsorcjach biofilmu.18,20 Zastosowano sondy ogólne wiążące się z Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; dalej EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; dalej LGCmix),9,10 oraz Bacteroidetes (Bac303).11 Dodatkowo użyto specyficznych sond wiążących się z Streptococcus mutans (MUT590)12,13 i Porphyromonas gingivalis (POGI).13,14 Ekstremalna twardość zastosowanych materiałów powierzchniowych (stal nierdzewna i żywica akrylowa) zmusiła nas do znalezienia nowych sposobów przygotowania biofilmu. Ponieważ materiałów tych nie można było łatwo przeciąć w kriotomie, zbadano różne metody pobierania próbek w celu uzyskania nienaruszonego biofilmu jamy ustnej. W niniejszym komunikacie przedstawiono najbardziej praktyczne z tych podejść. Małe płatki żywicy akrylowej z biofilmem zostały zeskrobane sterylnym skalpelem, dbając o to, aby nie uszkodzić struktury biofilmu. Do pobrania biofilmu z powierzchni stalowych użyto pęsety. Po pobraniu próbki zostały utrwalone i umieszczone bezpośrednio na szkiełkach przedmiotowych powlekanych polilizyną. Metodę FISH przeprowadzono bezpośrednio na tych szkiełkach z użyciem wspomnianych wyżej sond. Różne protokoły FISH zostały połączone i zmodyfikowane w celu opracowania nowego, łatwego w obsłudze protokołu.5,10,14,15 Następnie próbki przeanalizowano za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej. Udało się zwizualizować znane konfiguracje3,4,16,17, w tym formacje w kształcie grzybów oraz skupiska bakterii kokoidnych przeplatane kanałami. Ponadto przeanalizowano skład bakteryjny tych typowych struktur biofilmu i utworzono obrazy 2D oraz 3D.

Przedstawiamy protokół analizy strukturalnej i składu naturalnego biofilmu jamy ustnej pobranego z aparatów ortodontycznych z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) oraz konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM). Próbki biofilmu jamy ustnej pobrano z aparatów do rozszerzania podniebienia, zeskrobując z ich powierzchni płatki żywicy akrylowej i przekazując je do obróbki molekularnej.

Analiza biofilmu jamy ustnej w aparatach do rozszerzania podniebienia z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej i konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej

Mikroskopia konfokalna skaningowa (CLSM) naturalnych heterogenicznych biofilmów jest obecnie wspomagana przez szeroki zakres technik barwienia, z których jedna z...

Ogólnym celem tej procedury jest pozyskanie natywnego biofilmu jamy ustnej z aparatów do rozszerzania podniebienia w celu przeprowadzenia hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie aparatu do rozszerzania podniebienia, który przenosi czteromiesięczny biofilm pacjenta. Następnie z aparatu do rozszerzania podniebienia zeskrobuje się płatki żywicy akrylowej zawierające biofilm.Następnie przeprowadza się hybrydyzację fluorescencyjną in situ utrwalonego biofilmu bezpośrednio na powlekanych szkiełkach. Na koniec analizę zabarwionego biofilmu wykonuje się przy użyciu konfokalnej mikroskopii skaningowej. W rezultacie struktura i skład bakteryjnych społeczności biofilmu zostają ukazane za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ oraz konfokalnej mikroskopii skaningowej. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy napotkaliśmy grube biofilmy na aparatach ortodontycznych do poszerzania łuków, widoczne gołym okiem.Skłoniło nas to do rozważenia możliwych powiązań między nimi a chorobami przyzębia. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii jamy ustnej, takie jak rozmieszczenie przestrzenne i skład rodzimych biotopów jamy ustnej. Metoda ta ma charakter interdyscyplinarny i musi być realizowana przez różnych specjalistów.Elizabeth jest ortodontką, a Barbara biologiem molekularnym. Na początek, po czterech miesiącach w jamie ustnej, przy użyciu systemu suchego pola NOLA, odizoluj stały rozszerzacz podniebienny, aby uniknąć kontaminacji. Usuń urządzenie z jamy ustnej pacjenta, używając wysterylizowanych szczypiec, rękawiczek i tacek.Przechowywać obiekty w fiolkach o pojemności 120 ml w temperaturze -20 °C. Transportować je do laboratorium w lodzie i przetworzyć w ciągu 24 godzin w celu utrwalenia preparatów. Zeskrobać płatki biofilmu za pomocą sterylnego skalpela lub zebrać fragmenty sterylną pęsetą.Kluczowe jest zeskrobnięcie płatków żywicy akrylowej o odpowiedniej grubości, aby zapewnić zachowanie nienaruszonej struktury biofilmu w temperaturze lodowej. Należy dodać 4% roztwór paraldehydu, aż próbka zostanie całkowicie pokryta. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres od 3 do 12 godzin.Dłuższy czas utrwalania lub wyższa temperatura utrwalania mogą zmniejszyć przepuszczalność otoczek komórkowych komórek gram-ujemnych dla sond oligonukleotydowych. Po inkubacji usunąć roztwór paraldehydu i przemyć raz lodowatym 1x PBS. Powtórzyć ten krok dwa do trzech razy, aby usunąć pozostałości paraldehydu, zawiesić próbkę w jednej objętości lodowatego 1x PBS i dodać jedną objętość lodowatego 96% etanolu; przechowywać próbkę w temperaturze -20°C.Próbki mogą być przechowywane od kilku miesięcy do kilku lat w celu ich odwodnienia. Najpierw nanieś od 5 do 30 µL materiału próbki utrwalonej w paraldehydzie na szkiełko mikroskopowe. Susz próbkę przez 15 minut w temperaturze 46 °C lub dłużej w temperaturze pokojowej, aby umożliwić lizozymowi i formieidowi częściową degradację ścian komórkowych.Aby zapewnić lepszą penetrację sond, dodaj 250 µL roztworu lysozymu o stężeniu 1 mg/mL i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zanurzaj slajdy w 50%, 80% i 96% etanolu przez trzy minuty w każdym z nich. Efekt odwodnienia wynikający z serii stężeń etanolu spowoduje rozkład błon, co usprawni pobieranie sond oligonukleotydowych. Na koniec wysusz slajdy w temperaturze 46 °C, aby przeprowadzić hybrydyzację in situ U.Zacznij od przygotowania jednego mililitra świeżego buforu do hybrydyzacji i podgrzej go wstępnie do 47 °C. Rozmroź roztwory sond oligonukleotydowych na lodzie i przechowuj je w ciemności. Umieść kawałek papieru filtracyjnego w kwadratowej szalce Petriego i nanieś pipetą 800 µl buforu do hybrydyzacji na papier.Ponownie natychmiast zamknij komorę, ponieważ bufor zawiera formamid; dodaj 2 µL każdej sondy do 200 µL pozostałego buforu do hybrydyzacji. Dokładnie wymieszaj i nanieś mieszaninę na odwodnioną próbkę na szkiełku przedmiotowym, a następnie natychmiast umieść szkiełko poziomo w naczyniu i przykryj je. Inkubuj naczynie w inkubatorze przez 1–5 godzin w temperaturze 46 °C.Szalka pełni funkcję komory wilgotnościowej zapobiegającej odparowywaniu roztworu hybrydyzacyjnego z preparatu. W szczególności odparowanie formamidu może prowadzić do nieswoistego wiązania sond z komórkami niebędącymi celem. Przygotować 50 ml buforu piorącego i podgrzać go do 48 °C w kąpieli wodnej.Wyjmij naczynie z preparatem ze słupka hybrydyzacyjnego. Natychmiast wypłucz bufor hybrydyzacyjny niewielką objętością podgrzanego buforu do płukania i przenieś preparat do pozostałego buforu do płukania. Umieść probówkę zawierającą bufor do płukania i preparat z powrotem w kąpieli wodnej i inkubuj przez 10 do 15 minut w temperaturze 48 °C.Aby zabarwić próbki za pomocą więcej niż jednej sondy, powtórz poprzednie kroki po usunięciu buforu piorącego, pamiętając o rozpoczęciu od najwyższego, a następnie przejściu do niskiego stężenia. Wyjmij preparat z probówki i zanurz w lodzie.Zimna woda podwójnie destylowana przez dwie do trzech sekund. Aby usunąć pozostałości buforu płuczącego, należy wysuszyć preparat tak szybko, jak to możliwe, ponieważ szybkie suszenie ogranicza dysocjację sond.Wysuszone preparaty przechowywać w ciemności w temperaturze -20°C przez kilka tygodni bez znacznej utraty sygnału fluorescencji nadanego przez sondę. Aby obrazować próbki, nanieść dwie krople odczynnika Antifa w pobliżu lewej i prawej krawędzi szkiełka, a następnie nałożyć szkiełko nakrywkowe. Próbki obserwować pod konfokalnym skaningowym mikroskopem laserowym wyposażonym w odpowiednie filtry lub lasery; preparaty można przechowywać w temperaturze 4°C do siedmiu dni lub przemyć wodą dwukrotnie destylowaną i przechowywać w temperaturze -20°C przez dłuższy czas.Przedstawiono obrazowanie biofilmu z aparatów ortodontycznych stałych. Uzyskane płatki mogą zostać bezpośrednio hybrydyzowane na powlekanych szkiełkach przedmiotowych do mikroskopii, co pozwala na identyfikację różnych grup mikrobiomu jamy ustnej oraz bakterii w konfiguracji trójwymiarowej za pomocą specyficznych sond. Na tej rycinie biofilm został zabarwiony mieszaniną EUB i LGC; struktury pojawiające się na zielono zostały zabarwione na kolor żółty i niebieski.W tym przypadku biofilm zabarwiono mieszanką EUB back 3 0 3 oraz pogi. Bakterie z grupy bacteria dts pojawiają się w kolorze różowym i poor fire. Ramons gingivalis jest widoczny w kolorze żółtawo-białym, ponieważ wszystkie trzy sondy wiążą się z jego DNA, a nałożenie się kolorów skutkuje białym sygnałem morfologicznym.Można również zidentyfikować różnice między grupami bakterii, a także określone struktury, takie jak duże skupiska bakterii gronkowców. Przykłady takich skupisk pokazano tutaj, gdzie do barwienia zastosowano mieszankę EUB. Ponadto, typową strukturę biofilmu w kształcie grzyba można opracować za pomocą modelowania 3D danych z CLSM.Jest to animacja 3D biofilmu poddanego barwieniu mieszanemu EUB. Metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w proces tworzenia biofilmu indukowanego ortodontycznie. Może ona być również zastosowana do każdej innej sztucznej powierzchni w ludzkim organizmie, na której powstają złożone struktury biofilmu o potencjalnej patogenności.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania naturalnych biofilmów jamy ustnej do hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) oraz konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej. Należy pamiętać, że jest to dziedzina interdyscyplinarna, a sukces można osiągnąć jedynie pracując w zespole, dlatego zawsze należy z życzliwością odnosić się do współpracowników.

oral-biofilm-analysis-palatal-expanders-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza biofilmu jamistego ekspansorów podniebiennych metodą hybrydyzacji in situ z użyciem fluorescencji i mikroskopii skanującej laserowej konfokalnej

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Źródło: Tay, S. B., et.al. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje proces hamowania tworzenia biofilmu poprzez wprowadzenie enzymu zakłócającego sygnalizację komórkową bakterii. Enzym ten zapobiega produkcji przez bakterie pozakomórkowych substancji polimerowych, co ogranicza rozwój biofilmu na mikromisce o szklanym dnie. Na koniec struktura biofilmu jest wizualizowana za pomocą...

Mikroskopowa ocena hamowania powstawania biofilmu przez enzymy

Ten film demonstruje test w czasie rzeczywistym do monitorowania zewnątrzkomórkowego pH w biofilmach zębowych za pomocą czułej na pH sondy ratiometrycznej. Kiedy biofilm bakteryjny wyhodowany in situ jest wystawiony na działanie glukozy, obniżenie pH zewnątrzkomórkowego w pobliżu biomasy bakteryjnej protonuje sondę, prowadząc do jej zwiększonego stężenia wewnątrz bakterii. Rozbieżność w długości fali emisji między sondą protonowaną i nieprotonowaną jest wykorzystywana do obliczania pH w całej...

Test do monitorowania w czasie rzeczywistym zewnątrzkomórkowego pH w biofilmach dentystycznych

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Barwnik ratiometryczny o pH wrażliwym na pH jest używany w połączeniu z konfokalną laserową mikroskopią skaningową i cyfrową analizą obrazu do monitorowania zewnątrzkomórkowego pH w biofilmach zębowych w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie ratiometryczne zewnątrzkomórkowego pH w biofilmach zębowych

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Zmiany w mikrobiomie jamy ustnej w dzieciństwie budzą coraz większe zainteresowanie. Porównanie różnych badań mikrobiomu ujawnia brak ustandaryzowanych protokołów pobierania próbek. Ograniczona przestrzeń sprawia, że pobieranie próbek dźwiękowych bruzd poddziąsłowych u dzieci jest wyzwaniem. Próbkowanie punktowe na papierze jest tutaj szczegółowo przedstawione jako metoda z wyboru dla tego obszaru.

Pobieranie biofilmu w jamie ustnej do analizy mikrobiomu u zdrowych dzieci

Tutaj prezentujemy protokół oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych dla łączników protez dentystycznych, w tym analizę żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. Do analizy biofilmu w jamie ustnej wykorzystuje się model in situ związany z potężnymi technikami mikroskopowymi.

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Protokół opisuje hodowlę międzykrólestwowych biofilmów składających się z Candida albicans i Streptococcus mutans oraz przedstawia metodę opartą na mikroskopii konfokalnej do monitorowania pH zewnątrzkomórkowego wewnątrz tych biofilmów.

Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzyludzkich za pomocą mikroskopii konfokalnej

Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego podejścia do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy poprzez miejscowe nałożenie fluoroforowo oznaczonych dektranów o różnej wielkości cząsteczkowої na powierzchnię dziąseł in vivo, z późniejszym obrazowaniem ex vivo za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego.

Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników

Poznaj metodę analizy biofilmu jamy ustnej z ekspanderów podniebiennych przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i konfokalnej mikroskopii laserowej. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie struktury i składu bakteryjnych wspólnot biofilmowych.

Analiza biofilmu jamy ustnej ekspanderów podniebiennych metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in-situ i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza biofilmu jamy ustnej w aparatach do rozszerzania podniebienia z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej i konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej

Przeglądaj więcej filmów