JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:00 min. • April 30th, 2023
Barwienie włóknami elastycznymi pomaga zbadać inwazję komórek rakowych poza elastyczną blaszkę otrzewnową lub elastyczną tkankę podmiędzybłonkową
.Na początek dodaj roztwór nadmanganianu potasu do przetworzonego wycinka tkanki, a następnie zanurz w kwasie szczawiowym. Silne właściwości utleniające kombinacji nadmanganianu potasu i kwasu szczawiowego wybielają naturalny pigment z sekcji tkanki, aby zapobiec zakłóceniom procesu barwienia poprzez zaciemnienie morfologii włókien elastycznych.
Przepłukać szkiełko wodą i etanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości środka wybielającego. Następnie inkubuj próbkę w barwieniu elastyną, które zawiera kompleks żelazo-hematoksylina. Elastyna, główny składnik włókien elastycznych, wykazuje silne powinowactwo do kompleksów żelazo-hematoksylina.
Umyj szkiełko etanolem i wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości plam. Na koniec potraktuj próbkę barwnikiem przeciwbarwiącym zawierającym kwas pikrynowy i Ponceau S. Mniejsze cząsteczki kwasu pikrynowego przenikają do wszystkich typów tkanek, ale są mocno zatrzymywane przez gęsto teksturowane komórki mięśniowe i rakowe. W przeciwieństwie do tego, większe cząsteczki Ponceau S wypierają kwas pikrynowy w kolagenie o porowatej teksturze, powodując, że kolagen jest zabarwiony inaczej niż komórki mięśniowe i rakowe.
Obserwowane pod mikroskopem elastyczne włókna wyglądają jak niebiesko-czarne włókna. Kolagen barwi się na czerwono, a komórki mięśniowe i rakowe wydają się żółte. Żółte komórki rakowe przenikające przez niebiesko-czarną elastyczną blaszkę potwierdzają inwazję przerzutową.
Najpierw użyj bibuły, aby zetrzeć nadmiar roztworu ze szkiełka lub wokół chusteczki. Umieść szkiełka w warunkach odpowiadających temperaturze i wilgotności w pomieszczeniu. Dodaj kilka kropli nadmanganianu potasu do każdego szkiełka, aby je utlenić, upewniając się, że dodana objętość jest wystarczająca do pokrycia części tkanki na każdym szkiełku. Po 5 minutach opłucz utlenione szkiełka wodą destylowaną w słoikach z koplinu, powtarzając płukanie dwa do trzech razy i używając nowego słoika z wodą do każdego płukania. Tkanka powinna mieć zauważalny brązowy kolor.
Teraz dodaj kilka kropli kwasu szczawiowego do każdego szkiełka, aby je wybielić, upewniając się, że dodana objętość jest wystarczająca, aby pokryć sekcję tkanki na każdym szkiełku. Po 5 minutach spłucz szkiełka wybielacza wodą destylowaną, powtarzając płukanie dwa do trzech razy i używając nowego słoika z wodą do każdego płukania. Umyj krótko szkiełka w 95% alkoholu.
Umyte szkiełka zanurzyć w roztworze elastyny na 8 do 24 godzin. Następnie zanurz szkiełka bezpośrednio w 95% etanolu na 1 do 2 minut, aby dobrze rozróżnić każdy fragment tkanki. Całkowicie spłukać szkiełka wodą destylowaną.
Sprawdź pod mikroskopem niebiesko-czarne przebarwienia elastycznych włókien i szare tło. Lepiej jest nieco zaniżyć tkankę, ponieważ późniejsza przeciwbarwienie Van Giesona może również nieco usunąć elastyczną plamę.
Przeciwbarwić szkiełka w roztworze Van Giesona przez 1 minutę, upewniając się, że użyta objętość jest wystarczająca, aby całkowicie pokryć część tkanki na każdym szkiełku. Następnie szybko upuść 95% etanolu na plastry tkanki na kilka sekund, aby dobrze rozróżnić każdą sekcję tkanki.