Knockdown genów za pośrednictwem RNA za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów w iHSPC in vitro: system ekspresji shRNA oparty na lentiwirusie dostarczany do iHSPC w celu wyeliminowania określonej ekspresji genów

Zacznij od unieśmiertelnionej hematopoetycznej komórki macierzystej i progenitorowej, iHSPC, hodowli w pożywce zawierającej specyficzny hormon steroidowy i cytokinę krwiotwórczą, regulującą proliferację komórek w stanie niezróżnicowanym. Dodać odpowiedni polimer kationowy i wektory lentiwirusowe.

Rekombinowane wirusy przenoszą sekwencje kodujące krótkie RNA spinki do włosów, shRNA, skierowane do określonego genu gospodarza i genu markera oporności na antybiotyki.

Odwirować do komórek osadu i wirusów. Podczas inkubacji polimery kationowe neutralizują ładunki błony komórkowej, zwiększając wiązanie wirusa. Po fuzji błonowej materiał genetyczny wirusa i enzymy uwalniają się do cytoplazmy komórkowej. Genom wirusa jest transkrybowany wstecznie, przemieszcza się do jądra i integruje się z genomem gospodarza.

Pod wpływem specyficznego promotora w konstrukcie, konstrukt genu shRNA składający się z docelowej sekwencji pasującej mRNA, segmentu pętli i innej sekwencji komplementarnej do pierwszej, jest transkrybowany, tworząc shRNA z segmentem pętli niesparowanych nukleotydów. Po transkrypcji shRNA jest eksportowane do cytoplazmy.

Specyficzna rybonukleaza rozszczepia segment pętli, tworząc dwu