Inaktywacja genu docelowego oparta na systemie CreER-LoxP: indukowany tamoksyfenem system rekombinazy Cre do docelowego nokautu genu w modelu mysim

Zacznij od genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy składającego się ze zmodyfikowanego genomu, który zawiera miejsca LoxP - specyficzne sekwencje rozpoznawane przez enzymy rekombinazy Cre - flankujące gen będący przedmiotem zainteresowania. Mysz jest następnie transfekowana wektorem plazmidowym kodującym specyficzną dla narządu rekombinazę CreER, co prowadzi do integracji elementu wyrażającego rekombinazę CreER z genomem komórek wątroby.

Eksprymowana rekombinaza CreER, nieaktywne białko fuzyjne obejmujące rekombinazę Cre i zmutowaną domenę wiążącą ligand receptora estrogenowego, ER, oddziałuje i wiąże się z białkiem szoku cieplnego w cytoplazmie. To wiązanie ogranicza rekombinazę CreER w cytoplazmie.

Przygotuj roztwór tamoksyfenu, leku hydrofobowego, używając etanolu i odpowiedniego oleju. Teraz należy wstrzyknąć roztwór tamoksyfenu dootrzewnowo w lewy dolny kwadrant brzucha myszy, aby zapobiec uszkodzeniu narządów jamy brzusznej.

Wstrzyknięty tamoksyfen jest metabolizowany w wątrobie do 4-hydroksytamoksyfenu, 4-OHT. Ponadto 4-OHT, selektywny modulator receptora estrogenowego, wiąże się z domeną wiążącą ligand ER-rekombinazy, powodując jej zmianę konformacyjną. Prowadzi to do uwol