Edycja genów za pośrednictwem morfolino: technika knockdownu genów wykorzystująca translacyjne blokowanie oligonukleotydów morfolino w jednokomórkowych jajach ryb jaskiniowych

Morfolinos to krótkie, jednoniciowe, przeprojektowane oligonukleotydy różniące się strukturą szkieletu fosforanowego i cukru w porównaniu z naturalnymi nukleotydami. Cechy te zwiększają stabilność morfolinosów przy fizjologicznym pH. Pomimo tych różnic, morfoliny zawierają standardowe zasady nukleotydowe, które pomagają w projektowaniu oligonukleotydów komplementarnych do określonej sekwencji mRNA z pożądanego genu docelowego, który ma zostać powalony.

Aby przeprowadzić edycję genów sterowaną przez morfolinę, zacznij od pobrania jednokomórkowych jaj ryb jaskiniowych umieszczonych w studzienkach płytki iniekcyjnej agarozy. Wizualizuj półprzezroczyste i okrągłe jaja, aby zlokalizować woreczek żółtkowy - wypełnioną płynem strukturę obecną wewnątrz jajka.

Pobrać igłę do mikroiniekcji wstępnie wypełnioną roztworem zawierającym zaprojektowane morfoliny. Wstrzyknąć roztwór bezpośrednio do żółtka jaja, upewniając się, że morfoliny dostaną się do cytoplazmy komórki. Wewnątrz komórek gen docelowy tworzy mRNA, które jest transportowane do cytoplazmy.

W cytoplazmie wstrzyknięta morfolina hybrydyzuje z komplementarnym docelowym transkryptem mRNA w endogennym miejscu inicjacji i rozciąga się poza nie. Proces ten blokuje wiązanie większej podjednostki rybosomu z powstającym kompleksem inicjującym translację składającym się z małej podjednostki rybosomalnej skompleksowanej z pewnymi specyficznymi białkami.

Następnie postęp kompleksu inicjacji translacji jest sterycznie utrudniony, co zatrzymuje translację mRNA do białka. Wreszcie, docelowe stężenie białka zmniejsza się z powodu blokowania translacji przez morfoliny.

W dniu wstrzyknięcia należy za pomocą szklanej pipety przenieść jednokomórkowe komórki jajowe do płytki iniekcyjnej, wypełniając do pięciu rzędów płytki iniekcyjnej po 30 do 40 jaj w rzędzie. Utrzymuj jaja nawodnione niewielką ilością wody z systemu rybnego. Rozmrozić morfolino na lodzie i przygotować roztwór do wstrzykiwań tak, aby wstrzyknąć 400 pikogramów morfolina na jajko, używając długiej końcówki pipety Microloader lub dodając bolus o pojemności od 2 do 4 mikrolitrów na końcu.

Po załadowaniu wszystkich igieł należy za pomocą kleszczyków odciąć nadmiar długości od końcówek igły do wstrzykiwań i zamontować pierwszą igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowstrzykiwacza pikolitrowego. Następnie umieść naczynie do wstrzykiwań pod mikroskopem preparacyjnym i za pomocą mikromanipulatora przeniknij igłą do każdego jajka, a następnie wstrzyknij 1 nanolitr roztworu do wstrzykiwań morfoliny bezpośrednio do żółtka.