Ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej: technika elektroforezy oddzielająca cząsteczki bioaktywne od surowego ekstraktu Gymnema sylvestre

Zacznij od wstępnie zmontowanego ogniskowania izoelektrycznego, ogniwa IEF - jednostki elektroforezy w fazie ciekłej. Ta kolumna jest podzieloną na przedziały, poziomą porowatą komorą z wyraźnymi dodatnimi i ujemnymi końcami na końcach.

Teraz weźmy ekstrakt roślinny zawierający złożoną mieszaninę różnie naładowanych składników o różnych punktach izoelektrycznych, pI - pH, w którym ładunek netto cząsteczki wynosi zero.

Ekstrakt jest uzupełniany amfolilitami o zmiennych ładunkach, które ułatwiają późniejsze frakcjonowanie składników próbki.

Załaduj próbkę do portów ładowania kolumny. Obecnie kolumna IEF ma stałe pH. Następnie zastosuj wysokie napięcie, aby zainicjować elektroforezę.

Pod wpływem pola elektrycznego rozpuszczalne amfolity migrują w kierunku przeciwnie naładowanych elektrod i tworzą liniowy gradient pH w poprzek kolumny. Składniki próbki zaczynają migrować przez gradient pH fazy ciekłej, a te umieszczone przy pH poniżej ich pI mają ładunek dodatni netto.

Migrują one w kierunku elektrody ujemnej, dopóki komponenty nie osiągną swojego pI, gdzie ich ładunek neutralizuje się, a migracja ustaje. Podobnie, składniki o pH powyżej ich pI migrują w kierunku elektrody dodatniej i zatrzymują się, gdy osiągną pI. Spowoduje to rozdzielenie składników próbki na podstawie ich pI na zogniskowane przedziały. Zbierz oczyszczone frakcje do dalszej analizy.

Dodaj 0,6 grama ekstraktu roślinnego Gymnema sylvestre do 60 mililitrów wody destylowanej. Rozpuść ekstrakt roślinny, mieszając w rurce rolkowej przez pięć minut.

Aby usunąć nierozpuszczalne cząstki, odwirować roztwór o sile 10 000 x g przez pięć minut. Przenieś supernatant do szklanej zlewki o pojemności 150 mililitrów i dodaj amfolit, aby uzyskać 1% roztwór objętościowy, około 0,6 mililitra.

Za pomocą 50-mililitrowej strzykawki z 1,5-calową igłą o końcu o rozmiarze 19 załaduj roztwór do komórki IEF przez porty pobierania próbek. Następnie wyjmij ogniwo ze stojaka i postukaj w komorę elektrody, aby usunąć i usunąć wszelkie pęcherzyki.

Podłącz urządzenie do wody chłodzącej. Przy mocy dostarczanej na stałym poziomie 15 watów rozpocznij frakcjonowanie. Uruchom jednostkę IEF, aż voltage osiągnie stałą wartość, około trzech godzin.

Po naciśnięciu przycisku Harvest ON wyrównaj kołki kolektora frakcji z portami zbierania. Przepchnij szpilki przez taśmę uszczelniającą, aby rozpocząć zbieranie frakcji Gymnema sylvestre.