Przygotowanie neuronów korowych szczura E18 do podziału na przedziały w urządzeniu mikroprzepływowym

Witam i zapraszam do laboratorium Dr.Newly John. W poprzednim filmie pokazaliśmy, w jaki sposób produkujemy urządzenie neuronowe, platformę, która pozwala badaczowi oddzielić ciała komórkowe neuronów od czystej frakcji aksonalnej. Miękka litografia to technika stosowana do wytwarzania urządzeń, która polega na odlewaniu i utwardzaniu PDMS na płytce krzemowej zawierającej konstrukcję urządzenia, która została wcześniej wyprodukowana przy użyciu fotolitografii.

W tym filmie pokażemy, jak przygotować neurony korowe szczura spro dolly E 18 i jak załadować neurony do urządzenia neuronowego. Chciałabym przedstawić Wam Kianę Lee. Dzisiaj będzie organizować demonstracje.

Przed rozpoczęciem pracy ważne jest, aby wszystkie niezbędne podłoża i odczynniki były podgrzane do 37 stopni w łaźni wodnej. Możesz zobaczyć neuro podłoże podstawowe 0,25% trypsyny i DMEM zawierające 10% FBS. Ważne jest, aby upewnić się, że wszystko, co znajduje się w okapie, które ma być użyte do naprawy komórek, zostało wysterylizowane i przetarte 70% etanolem.

Najpierw kaptur do hodowli tkankowej przeciera się 70% etanolem. Następnie plastikowe stojaki służące do trzymania rurek są spryskiwane etanolem. Następnie gumowa kulka używana w procesie tri striation jest czyszczona etanolem.

Ważne jest, aby zrobić to wcześnie, aby miał wystarczająco dużo czasu na wyschnięcie. Następnie niezbędne odczynniki przeciera się etanolem i przenosi do maski. Dwa kawałki kory płodowej szczura E 18 reprezentujące jeden wcześniej wypreparowany mózg umieszcza się w 15 ml probówce zawierającej jeden ml, lodowato zimny, wolny od wapnia, magnezu bufor preparacyjny, jeden ml 0,25% trypiny EDTA dodaje się do kory w buforze rozwarstwiającym, doprowadzając końcową objętość do dwóch młynów, a końcowe stężenie prób do 0,125%Następnie umieszcza się probówkę 15 ml zawierającą korę z dodaną teraz trypsyną w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni przez osiem minut, podczas gdy kora płodu inkubuje w temperaturze 37 stopni w trypszynie.

Trzy pipety z pastą są polerowane ogniowo. Końcówkę szklanej pipety umieszcza się w kontakcie z płomieniem w pobliżu niebieskiej części płomienia i powoli obraca, aż tylko otwór zmieni kolor na pomarańczowy. Gdy zmienił kolor na pomarańczowy.

Ważne jest, aby obracać szklaną pipetę, aby się nie zapadła. Zwróć uwagę, że otwory szklanych pipet są kolejno mniejsze. Ważne jest również, aby pamiętać, że nie chcesz, aby otwory były zbyt małe, ponieważ może to spowodować lizę komórek po inkubacji kory przez osiem minut w temperaturze 37 stopni z trypsyną, 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS dodaje się do kory, aby zatrzymać reakcję trypsyny.

Probówkę o pojemności 15 ml zawierającą korę i DMEM 10% FBS odwirowuje się z prędkością 2 500 obr./min przez dwie minuty. W komorze bezpieczeństwa biologicznego odsysanie próżniowe przymocowane do szklanej pipety służy do usuwania supernatantu z kory. Uważaj, aby nie naruszyć ani nie usunąć granulki.

Jeden ml neuronalnej pożywki podstawowej zawierającej B 27 i glutaminian dodaje się do osadu kory mózgowej i delikatnie pipetuje w górę iw dół. Bardzo ważne jest, aby podczas pipetowania w górę i w dół nie tworzyć pęcherzyków powietrza, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą uszkodzić komórki w wyniku utleniania. Następnie, wypolerowana ogniowo tylna pipeta z najszerszym otworem, jak używana do tri kory, poprzez przymocowanie sterylnej gumowej gruszki do końca pipety i pipetowanie w górę iw dół około pięć razy.

Uważaj, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza. Porządku. Proces ten był kontynuowany w przypadku pozostałych dwóch szklanych pipet, z których każda miała zmniejszony rozmiar otworu. Jak wspomniano wcześniej, ważne jest, aby upewnić się, że podczas procesu tristriation nie zostaną wprowadzone żadne pęcherzyki.

Powinieneś również zauważyć, że nie widzisz już żadnych widocznych fragmentów. Ważne jest, aby zachować potrójną ocenę do momentu, gdy nie będziesz już widzieć żadnych fragmentów kory mózgowej w mediach. Po zaognieniu komórki są ponownie odwirowywane z prędkością 2 500 obr./min przez dwie minuty.

Jest to mniej więcej przybliżony rozmiar granulki, której można by się spodziewać po dwóch kawałkach kory mózgowej. Po odwirowaniu sup natin jest ponownie usuwany z osadu komórkowego. Po usunięciu super natyny jeden ml podłoża neuro podstawowego zawierającego B 27 i glutaminian dodaje się do kory mózgowej i wykorzystuje do resusu zawiesinia kory.

Osad komórkowy jest ponownie ostrożnie pipetowany w górę iw dół, aby uniknąć dodawania pęcherzyków i zapewnić, że osad komórkowy jest równomiernie rozprowadzony i rozdrobniony. Do zawiesiny komórkowej dodaje się jeszcze jeden mil podłoża neuropodstawnego, zwiększając końcową objętość do dwóch mil. Następnie zawieszony roztwór komórkowy jest filtrowany przez sitko komórkowe BD biosciences o wielkości 40 mikronów w celu policzenia komórek i oceny żywotności.

60 mikrolitrów świeżej pożywki neuronalnej umieszcza się w sterylnej probówce mikro fuge. Następnie dodaje się 20 mikrolitrów komórek do 60 mikrolitrów pożywki neuropodstawnej, a na koniec 20 mikrolitrów błękitu trianowego dodaje się do komórek w pożywce neurologicznej. Błękit trianowy zabarwi komórki, które nie są już żywe po zabarwieniu komórek błękitem trianowym.

Pipetujemy 20 mikrolitrów na hemocytometr i oglądamy je pod mikroskopem. Żywe komórki wydają się przezroczyste i półprzezroczyste, podczas gdy komórki, których błony są przebite, barwią się na niebiesko z powodu błękitu trianowego. Zazwyczaj uzyskujemy około 2,5 miliona komórek i 8 milionów komórek na korę.

Zwykle uzyskujemy dwa kawałki kory mózgowej z jednym mózgiem, a komórki są ponownie zawieszone w końcowej objętości dwóch mil. Zatem końcowe stężenie komórek wynosi zwykle od 2,5 miliona komórek na promil do 8 milionów komórek na promil. Zwykle ładujemy około 20 mikrolitrów ogniw na urządzenie.

Daje nam to zakres ogniw na urządzenie od 50 000 ogniw do 160 000 ogniw. Gęstość komórek może się zmieniać w zależności od zastosowania. Jednak wysiewanie pierwotnych neuronów o zbyt niskiej gęstości zwykle prowadzi do śmierci komórki Urządzenia Wcześniej przygotowane zawierające podstawowe pożywki nerwowe są wprowadzane do komory bezpieczeństwa biologicznego w celu utrzymania sterylności.

Nadmiar mediów ze studzienek jest usuwany przez sekcję próżniową. Należy jednak uważać, aby nie usunąć wszystkich nośników. W głównym kanale musi być trochę mediów, tylko media zasysane ze zbiorników.

Tylko 20 mikrolitrów ogniw jest nakładanych na lewy górny zbiornik urządzenia. Komórki wpływają do urządzenia i przyczepiają się do powierzchni poddanej obróbce PLL. Tutaj możecie zobaczyć komórki, które spływają w dół przez główny kanał, i zaczniecie widzieć, że niektóre z nich są faktycznie przyczepione do szkła.

Po załadowaniu urządzenia zawierające komórki umieszcza się z powrotem w inkubatorze na około 10 minut, aby umożliwić przyczepienie się komórek. Po 10 minutach w inkubatorze urządzenia są ponownie umieszczane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a zbiorniki są napełniane pożywką, a następnie urządzenia są umieszczane z powrotem w inkubatorze. Kilka ważnych rzeczy, na które należy zwrócić uwagę, w zależności od inkubatora i poziomu wilgotności potrzebnej pożywce, może być konieczna wymiana w urządzeniach co dwa do trzech dni.

Dobrą praktyką jest umieszczanie świeżych mediów w górnych studzienkach i pozwalanie, aby część świeżych mediów przepływała przez urządzenie i do głównych kanałów przed napełnieniem wszystkich zbiorników. Neurony są tutaj wizualizowane za pomocą wapnia i barwnika przenikającego komórki, który barwi żywe komórki. Tutaj możesz zobaczyć komorę so lub stronę komórki urządzenia, która zawiera ciała komórek, aksony i dendryty.

Gdy przesuwamy się po urządzeniu, można zobaczyć mikro rowki, przez które wyrastają aksony, aby dotrzeć do drugiej strony urządzenia, strony aksonu, która zawiera czystą frakcję aksonalną. W celach demonstracyjnych. Te znakowane fluorescencyjnie komórki zostaną wykorzystane do zilustrowania procedury ax otomii.

Jedną z właściwości urządzenia neuronowego jest to, że pozwala ono badaczowi na wykonanie ex otomii, czyli odcięcia aksonów od czystej frakcji aksonalnej urządzenia. W celu prowadzenia badań, takich jak badanie regeneracji aksonów. Keano zademonstruje teraz, jak wykonuje się ex otomię w urządzeniu neuronowym, ex otomia jest wykonywana przez próżnię.

Sterylną szklaną pipetę umieszcza się w dolnym otworze studzienki po stronie aksonalnej, pożywkę odsysa się za pomocą próżni. Wszystkie nośniki są całkowicie usuwane z aksonalnej strony urządzenia, w tym media w głównym kanale. Aby powtórzyć proces po usunięciu pożywki, 150 mikrolitrów pożywki jest wtłaczane do głównego kanału, umieszczając końcówkę pipety w otworze głównego kanału i wciskając pipetę na siłę.

Następnie próżnia jest przykładana do otworu głównego kanału i górnej studzienki po stronie aksonalnej urządzenia. Próżnia jest ponownie używana do usuwania wszystkich mediów od strony aksonów, w tym kanału głównego. Po raz kolejny 150 mikrolitrów pożywki jest wtłaczane do głównego kanału poprzez umieszczenie końcówki pipety w otworze głównego kanału i mocne wciśnięcie pipety.

W tym momencie badacz może obejrzeć urządzenie pod mikroskopem, aby sprawdzić skuteczność cięcia aksonów. Jeśli aksony nie są wystarczająco przycięte, proces można powtórzyć ponownie w razie potrzeby. W tym filmie pokazaliśmy, jak przygotować neurony korowe E 18 i załadować je do urządzenia neuronowego.

Podstawową zaletą tych urządzeń jest możliwość oddzielenia i podziału hodowli ciał komórek neuronalnych po jednej stronie urządzenia od czystej frakcji aksonalnej po drugiej stronie urządzenia. Mamy nadzieję, że ten film okazał się pouczający i pomocny. To tyle z John Lab.

Dzięki za oglądanie.