Test agregacji komórek w celu wykrycia interakcji trans między cząsteczkami adhezyjnymi komórek

W układzie nerwowym interakcje międzykomórkowe - interakcje między specyficznymi cząsteczkami adhezyjnymi komórek synaptycznych, białkami transbłonowymi, na neuronach presynaptycznych i postsynaptycznych - tworzą kompleks w synapsach, pośrednicząc w sygnalizacji transsynaptycznej.

Aby wykryć interakcje międzykomórkowe między cząsteczkami adhezji komórek synaptycznych wyrażonymi na ludzkich embrionalnych komórkach nerki za pomocą testu agregacji komórek, należy rozpocząć od transfekowanych zawiesin komórek.

Jedna transfekowana populacja komórek wyraża pożądaną cząsteczkę adhezyjną komórek presynaptycznych i białko zielonej fluorescencji; druga wyraża specyficzną cząsteczkę adhezyjną komórek postsynaptycznych i białko czerwonej fluorescencji. Uzyskuje się również dwie populacje komórek wykazujące ekspresję białek zielonej i czerwonej fluorescencji.

Odwirować komórki. Ponownie zawiesić komórki w odpowiednich pożywkach uzupełnionych jonami wapnia. Wymieszaj równo transfekowane komórki obu populacji w probówce. Powtórz te czynności dla pozostałych populacji komórek.

Podczas inkubacji jony wapnia wiążą się z określonym miejscem na białku presynaptycznym ulegającym ekspresji w populacji komórek. Zwiększa to interakcję białka presynaptycznego z postsynaptycznym ligandem innej populacji komórek, ułatwiając wiązanie, pośrednicząc w heterofilnej adhezji komórek między tymi komórkami i prowadząc do agregacji komórek.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym zobrazuj komórki za pomocą odpowiednich kanałów, wizualizując zieloną i czerwoną fluorescencję komórek. Przetwórz obrazy.

W populacjach komórek wykazujących ekspresję tylko białek fluorescencyjnych nie obserwuje się agregacji. Agregacja komórek jest wizualizowana jako żółta ze względu na nakładanie się na siebie zielonych i czerwonych komórek fluorescencyjnych wyrażających cząsteczki adhezyjne komórek synaptycznych, co sugeruje interakcje międzykomórkowe między cząsteczkami.

48 godzin po transfekcji HEK293T komórek należy pobrać komórki z płytki 6-dołkowej w celu agregacji. Najpierw umyj każdą studzienkę dwukrotnie PBS. Następnie, aby delikatnie oddzielić komórki, dodaj 1 mililitr 10-milimolowego EDTA do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po pięciu minutach inkubacji delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki, i zbierz każdą studzienkę do osobnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować probówki o sile 500 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.

Podczas gdy komórki granulują, przygotuj sześć probówek inkubacyjnych, oznaczając górne części probówek do mikrowirówek warunkami eksperymentalnymi. Należy użyć każdej permutacji GFP i mCherry.

Usuń supernatanty z 15-mililitrowych stożkowych probówek i ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach pożywki. Za pomocą hemocytometru policz komórki w każdej stożkowej probówce. Następnie podwielokrotnić 200 000 komórek z każdego stanu do odpowiedniej probówki inkubacyjnej, aby uzyskać mieszankę jeden do jednego w łącznej objętości 500 mikrolitrów. Umieścić probówki inkubacyjne w powolnym rotatorze probówek w temperaturze pokojowej.

Aby ocenić agregację, na początku badania i ponownie po 60 minutach, należy odpipetować 40 mikrolitrów z probówki inkubacyjnej na naładowane szkiełko mikroskopowe. Akwizycja wyjściowa powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe po dodaniu komórek do probówki mikrowirówkowej.

Wyobraź sobie slajd pod wpływem fluorescencji zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym. Dla każdego slajdu uchwyć obrazy trzech różnych pól widzenia w jednej płaszczyźnie ogniskowej.