JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:20 min. • July 8th, 2025
W przypadku testu dwuhybrydowego drożdży należy wziąć genetycznie zmodyfikowaną, aktywnie rosnącą zawiesinę komórek drożdży pozbawioną białka aktywującego transkrypcję, GAL4. Komórki te nie mogą syntetyzować leucyny i tryptofanu.
Dodaj parę plazmidów ekspresyjnych: jeden kodujący leucynę i domenę wiążącą DNA, DNA-BD, GAL4, połączone z docelową domeną białkową, a drugi kodujący tryptofan i domenę aktywatora, AD, GAL4 połączone z inną domeną białka docelowego.
Dodaj bufor zawierający odpowiednie czynniki do transformacji. Szok termiczny komórek, aby spowodować przejściowe tworzenie się porów, ułatwiając wychwyt plazmidu komórkowego. Ostudzić, aby ponownie uszczelnić pory. Umieść komórki na selektywnej pożywce wzrostowej pozbawionej leucyny i tryptofanu.
Przekształcone komórki wykazujące ekspresję dwóch białek hybrydowych syntetyzują leucynę i tryptofan, przeżywają i tworzą kolonie.
DNA-BD połączony z domeną białkową wiąże się ze specyficzną sekwencją DNA w górnym odcinku regionu promotora genu kodującego β-galaktozydazę. Jeśli docelowe domeny białkowe wchodzą w interakcje, AD i DNA-BD zbliżają się do siebie, powodując rekonstrukcję funkcjonalnego GAL4, co prowadzi do ekspresji genu β
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych