Pomiar migracji komórek NK w odpowiedzi na bodźce chemotaktyczne

Zacznij od dodania chemoatraktantów, takich jak chemokina, do płytki wielodołkowej.

Umieść w studzience przepuszczalną komorę transwell o odpowiedniej wielkości porów. Dodaj zawiesinę komórek NK lub natural killer do górnej komory i inkubuj.

Kilka cząsteczek chemokiny dyfunduje przez błonę i wiąże się z receptorami komórek NK. Uruchamia to szlaki sygnałowe, które promują zmiany cytoszkieletu, powodując kierunkowy ruch komórek w kierunku wyższego stężenia chemoatraktantu w dolnej komorze.

Po inkubacji przenieś ustaloną objętość migrowanych komórek z dolnej komory do aktywowanego fluorescencją sortowania komórek lub probówki FACS. Dodaj z góry określoną liczbę fluorescencyjnych kulek zliczających i wykonaj liczenie komórek w oparciu o FACS.

Korzystając z poniższego wzoru, określ bezwzględną liczbę migrowanych komórek NK w próbce.

Wykres punktowy podaje liczbę zliczających koralików i komórek oddzielonych jako odrębne obszary, na podstawie ich właściwości fluorescencji i rozpraszania.

Aby zmierzyć migrację komórek NK w odpowiedzi na bodźce chemotaktyczne, należy zebrać ludzkie komórki NK z 70% do 80% zlewającej się hodowli i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 2,5 x 10⁶ komórek na mililitr pożywki do hodowli komórek NK bez surowicy. Następnie dodaj 600 mikrolitrów pożywki bez surowicy zawierającej interesujący nas chemoatraktant z komórek NK na studzienkę.

I umieść jedną wkładkę hodowlaną o średnicy 6,5 milimetra z porami 5 mikrometrów w każdym dołku pożywki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów komórek NK do górnej komory każdej wkładki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery godziny.

Pod koniec inkubacji przenieś całą objętość nieprzylegających migrowanych komórek z dna każdej studzienki do pojedynczych 5-mililitrowych probówek FACS i dodaj 15 mikrolitrów z góry ustalonej liczby kulek zliczających cytometrii przepływowej do każdej probówki. Następnie, za pomocą cytometru przepływowego, oceń każdą próbkę komórek zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej i oblicz bezwzględną liczbę migrowanych komórek NK za pomocą wzoru.