Name: Supresja in vitro u ludzi jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu nierównowagi immunologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę in vitro do oceny funkcji komórek Treg i identyfikacji ryzyka cukrzycy typu 1. Ta technika umożliwia wczesne wykrywanie nierównowagi immunologicznej u osób zagrożonych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie było wspierane przez Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetes przy Medical College of Wisconsin oraz Children's Research Institute of Wisconsin. Podmioty finansujące nie brały udziału w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych ani w przygotowaniu manuskryptu.

1. Przed przygotowaniem testu supresji należy pokryć kulek aktywowanych tosylanem przeciwciałem anty-CD3 przeciwko ludzkim komórkom (klon UCHT1, stężenie końcowe 1μg/ml) w celu stymulacji komórek, a następnie sprawdzić wydajność pokrycia kulek, przeprowadzając test proliferacji in vitro z użyciem ludzkich limfocytów T
<ol>
<li>Odmierzyć 1ml kulek M-450 aktywowanych tosylanem z oryginalnej fiolki, umieścić w statywie magnetycznym i trzymać do czasu, aż wszystkie kulki przyłączą się do ścianki probówki. Usunąć bufor, gdy probówka wciąż znajduje się w statywie magnetycznym. Wyjąć probówkę ze statywu magnetycznego i dodać 1ml buforu 1, ponownie umieścić probówkę w statywie magnetycznym i usunąć bufor 1, gdy probówka znajduje się w statywie; resuspender kulki w 1ml buforu 1 i dodać 40μl przeciwciała anty-CD3 przeciw ludzkim antygenom, mieszać w temperaturze 37°C przez 15 minut, dodać 0,1%w/v BSA i kontynuować mieszanie przez kolejne 16 godzin.</li>
<li>Przemyć kulki w buforze 2 dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze 2-8°C oraz raz w buforze 3 przez 5 minut w temperaturze 2-8°C, korzystając ze statywu magnetycznego zgodnie z powyższym opisem; usunąć bufor i resuspender kulki w 1ml buforu 2; końcowe stężenie kulek wynosi 4x108/ml i są one gotowe do użycia.</li>
<li>Nanieść do płytki 96-dołkowej w trzech powtórzeniach 50 0 i 25 0 PBMC/dołek i dodać zmienną liczbę kulek powlekanych CD3 (4x108 kulek/ml, CD3 1μg/ml, na przykład 1, 2, 3, 4, 5 kulek/komórkę), aby określić optymalną liczbę kulek na komórkę. Po 72 godzinach hodowli dodać 1μCi [3H] tymydyny i kontynuować inkubację w temperaturze 37°C przez kolejne 16 godzin. Zebrać komórki do płytki do zbioru Multiscreen (Millipore), dodać ciecz scyntylacyjną i odczytać liczbę zliczeń na minutę (cpm)/dołek przy użyciu urządzenia Top Count NXT (Packard, CT). Przyjąć taki stosunek kulek/komórkę, przy którym wartości cpm wynoszą powyżej 50, ale mniej niż 15 0, aby uniknąć nadmiernej stymulacji komórek Treg, co mogłoby doprowadzić do utraty funkcji supresyjnej. Zazwyczaj stosunek 3 kulek/komórkę stymuluje zarówno komórki responder, jak i Treg we wszystkich grupach badanych do tej pory pacjentów1-4.</li>
</ol>
2. Izolacja PBMC z krwi pełnej od zdrowych dawców lub z ludzkich leukopaków bądź warstwy leukocytowej (BC), zazwyczaj pobieranych od zdrowych ochotników i dostępnych bezpłatnie w lokalnych centrach transfuzjologii (Rysunek 1)
<ol>
<li>Rozcieńczyć BC (˜50ml) w stosunku 1:6 za pomocą PBS (dodać 250ml), tak aby uzyskać całkowitą objętość 30ml. Powoli nanieść 25ml rozcieńczonych BC na warstwę 15ml Ficoll-Paque PLUS w probówkach typu Falcon 50ml, uważając, aby nie zmieszać warstw. Centryfugować przy 80xg (1400rpm w wirówce Sorvall z rotorem z koszyczkami wahadłowymi SH-30) przez 30 minut w temperaturze 4°C, przy wyłączonych hamulcach. </li>
<li>Ostrożnie zebrać warstwę PBMC (faza pośrednia) i przenieść ją do nowej probówki Falcon 50ml. Przemyć PBMC, dopełniając probówki do 50ml za pomocą DPBS. Zebrać 2 pellety komórkowe do jednej probówki. Centryfugować przy 40xg przez 10 min w temperaturze 4°C. Powtórzyć etap płukania dwukrotnie, za każdym razem łącząc 2 pellety komórkowe w jednej probówce. Połączyć wszystkie pellety komórkowe w jednej probówce 50ml. </li>
<li>Policzyć PBMC za pomocą testu wykluczania błękitu trypanu (Trypan Blue). Przygotować rozcieńczenie 1:10 w błękicie trypanu, dodając 20μl PBMC do 180μl barwnika Trypan Blue. Dobrze wymieszać i niezwłocznie pobrać 20μl do odczytu w komorze licznikowej (hemacytometrze). Policzyć wszystkie niezbarwione oraz tylko niebieskie barwione komórki znajdujące się w dwóch kwadratach, z których każdy zawiera 16 mniejszych pól. Obliczyć średnią z obu wartości i pomnożyć przez 10. Wynik podzielić przez 10, aby otrzymać liczbę PBMC/ml. Procent żywych komórek obliczyć według wzoru [1-(liczba niebieskich komórek/całkowita liczba komórek)x100]. Kontynuować procedurę, jeśli żywotność wynosi ≥95%.</li>
</ol>
3. Wstępna selekcja komórek T CD4 metodą MACS
<ol>
<li>Przed przejściem do kolejnych etapów przenieś 1ml PBMC do nowej probówki i dodaj 4ml medium, aby przygotować komórki do naświetlania dawką 50rad – będą one służyć jako komórki prezentujące antygen (APC).</li>
<li>Wirowarkuj pozostałą część komórek przy 250xg w buforze PBS/2mM EDTA/0,5%BSA przez 10min w temperaturze 4°C. Odlej supernatant i resuspenduj komórki w 4ml buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA.</li>
<li>Dodaj 20μl mikrokulek MACS anti-CD4 i inkubuj w temperaturze 4°C przez 20 minut.</li>
<li>Przemyj, dodając 40ml buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA, i wiruj przy 250xg przez 10min w temperaturze 4°C. Odlej supernatant i resuspenduj w 8ml odgazowanego buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przeprowadź filtrację zawiesiny komórkowej przy użyciu filtrów do wstępnej separacji przed nałożeniem jej na kolumnę LS.</li>
<li>Podziel zawiesinę komórkową i nałóż po 4ml na każdą skalibrowaną kolumnę LS (zawierającą 3ml odgazowanego buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA). Kolumna LS jest zamocowana w separatorze MidiMACS. Zanim zawiesina komórkowa spłynie, ponownie przepuść frakcję przepływową lub dodaj 3ml odgazowanego buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA w temperaturze pokojowej i pozwól mu przepłynąć. Dodawaj bufor do momentu, aż eluowane będzie przezroczyste.</li>
<li>Pipetuj 5ml odgazowanego buforu na kolumnę LS, wyjmij kolumnę LS z separatora MidiMACS i umieść ją w nowej sterylnej probówce zbiorczej o pojemności 15ml, pozwalając na spłynięcie ok. 1,0ml. Włóż tłok do kolumny i powoli wypchnij resztę objętości.</li>
<li>Powtórz tę procedurę dla obu kolumn LS i połącz dwie frakcje CD4+. Dodaj do 50ml PBS i policz komórki. Oczekiwana wydajność wynosi do 5x108 komórek. Wirowarkuj przy 40xg przez 10 minut i dokładnie resuspenduj komórki w 2ml buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA.</li>
</ol>
4. Izolacja metodą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) (Rysunek 2)
<ol>
<li>Przygotować koktajl przeciwciał przeciwko markerom CD dla następujących markerów powierzchni komórkowych (przechowywać w ciemności): 20 μl przeciwciał anty-ludzkich CD8-FITC (klon RPA-T8), 20 μl przeciwciał anty-ludzkich CD14-FITC (klon M5E2; receptor LPS), 20 μl przeciwciał anty-ludzkich CD32-FITC (klon FLI8.26; FcγR typu II) oraz 6 μl przeciwciał anty-ludzkich CD16-FITC (klon M5D12; łańcuch α GM-CSFR), a opcjonalnie dodać 40 μl przeciwciał anty-ludzkich CD4-APCCy7 (klon RPA-T4).</li>
<li>Odlać 5 μl z 2 ml zawiesiny komórkowej i zbarwić 2 μl koktajlem barwiącym; jest to probówka służąca do wyznaczenia progu (Fluorochrome Minus One-FMO)5.</li>
<li>Dodać 50 μl przeciwciał anty-ludzkich CD25-PE (klon M-A251; IL-2Rα) do koktajlu barwiącego, dodać koktajl do zawiesiny komórkowej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4°C. Przemyć komórki w buforze PBS, odwirować przy 40xg przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki do uzyskania stężenia 107/ml.</li>
<li>Przygotować niebarwione komórki oraz komórki lub kuleczki zbarwione pojedynczym fluorochromem, aby wykorzystać je jako kontrolę kompensacji podczas sortowania komórek na urządzeniu FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ).</li>
<li>Nabyć dane dla komórek w probówce FMO, co pozwoli użytkownikowi ustawić próg sortowania komórek T CD25+ (Rysunek 2a). Ustawić bramkę wokół komórek FITC-ujemnych, aby wykluczyć komórki FITC-dodatnie obejmujące monocyty, makrofagi i wszystkie pozostałe komórki CD4+ niebędące limfocytami T (Rysunek 2b).</li>
<li>Na osobnym wykresie wyznaczyć bramki dla komórek T CD25-, CD25low oraz CD25high-Tregs (górne 1% komórek wykazujących najwyższą ekspresję CD25) (Rysunek 2c). Subpopulacje komórek zazwyczaj charakteryzują się wysoką czystością (Rysunek 2d, 2e i 2f).</li>
<li>Odwirować probówki z komórkami przy 40xg przez 10 minut i przechowywać je w lodzie do czasu wysiania.</li>
</ol>
5. Przygotowanie hodowli komórkowej na płytce 96-dołkowej (schemat dołączony jako Tabela 1) w objętości 20μl/dołek
<ol>
<li>Aliquota 50μl kulek pokrytych przeciwciałami anty-CD3 (1 μg/ml) obliczone na 3 kulki/komórkę respondenta w jednej studzience, resuspenderowane w pełnej pożywce z dodatkiem 10% puli ludzkiej surowicy AB w 96-dołkowych płytkach z półkolistym dnem (U-bottom). (Na przykład, aby przygotować 2 ml pożywki z kulkami powlekanymi CD3, należy pobrać 7.5μl z roztworu CD3-coated beads – stężenie końcowe 4x108/ml i rozcieńczyć w 2 ml pożywki; każda 50μl będzie zawierać 75 0 kulecek (3 kuleczki/komórka).</li>
<li>Rozcieńczyć napromieniowane APC do stężenia 5x105stężenie komórek /ml i dodać 50μl (będzie zawierać 2,5 x 104 komórki) do każdej studni z wcześniej dodaną stymulacją, w tym do studni oznaczonych jako „same Tregs”, „same APC” oraz „same medium” w Tabeli 1.</li>
<li>Dodaj 2,5 x 104/do studzienki komórki T CD4+CD25- lub CD4+CD25low w trzech powtórzeniach, zgodnie z projektem przedstawionym w Tabeli 1.</li>
<li>Dodać komórki Treg do kokultur (wiersz B, tabela 1) w stosunku 1:10 (2 50 komórek Treg) oraz do studni oznaczonych jako „Tregs only” i inkubować płytkę w 37°C w CO2 inkubator z 5% CO22, w nasyconej wilgotności przez 72 godziny.</li>
<li>Przemyj dołki za pomocą 1μCi [3tymidyną i kontynuować inkubację w 37°C przez następne 16 godzin.</li>
</ol>
6. Zbieranie i liczenie
<ol>
<li>Zebrać komórki na wieloformatowej płytce do zbioru przy użyciu systemu Packard filtermate harvester lub systemu alternatywnego.</li>
<li>Dodać płyn scyntylacyjny (Microscint 20) i przykryć płytkę do zbioru przezroczystą plastikową pokrywą w przygotowaniu do końcowego etapu.</li>
<li>Odczytać liczbę zliczeń na minutę (cpm)/dołek za pomocą urządzenia Top Count NXT (Packard, CT) lub systemu alternatywnego.</li> 
</ol>
7. Obliczanie procentu supresji
<ol>
<li>Ponieważ komórki hodowano w trzech powtórzeniach, dla każdego wariantu obliczano średnią. Jeśli współczynnik zmienności wynosi &gt;30%, wartość odstająca zostaje odrzucona i wyciągnięta jest średnia cpm z dwóch dołków. Procent hamowania oblicza się według wzoru [(s-c)/s] x 10%, gdzie s=cpm w monokulturze, a c=cpm w kokulturze.</li>
<li>Jako naiwne (CD25-) i in vivo aktywowane efektorowe limfocyty T (CD25low) wysiewa się jako limfocyty T odpowiadające; różnica w zdolności limfocytów Treg do supresji każdej z tych subpopulacji jest rejestrowana i wykorzystywana jako potencjalny funkcjonalny wskaźnik prognostyczny, w oparciu o założenie, że komórki aktywowane są trudniejsze do supresji.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki:
Znaczna zmienność metod stosowanych i wyników uzyskiwanych w testach supresji ludzkich komórek in vitro skłoniła nas do przeprowadzenia kompleksowego badania czynników wpływających na ten test1. Opracowaliśmy test, który sprawdza nie tylko funkcję Treg, ale także ich czystość, biorąc pod uwagę niski stosunek Treg:Teff (1:10), który ustaliliśmy wcześniej6. Ponadto komórki Treg różnią się zdolnością do skutecznej supresji naiwnych i aktywowanych in vivo limfocytów T, nawet u zdrowych osób, co pokazano na Rysunku 3 oraz w naszych poprzednich badaniach2,4; różnica ta staje się bardziej wyraźna w przypadku zaburzenia równowagi immunologicznej, np. u osób narażonych na rozwój T1D. Test sprawdził się bardzo dobrze w badaniu, w którym porównaliśmy funkcję supresyjną naturalnych (nTregs), indukowanych (iTregs) oraz namnażanych in vitro nTregs, co pozwoliło nam porównać ich funkcję pomiędzy zdrową grupą kontrolną a osobami z T1D w fazie wczesnej (RO) i późnej (LS). Stwierdziliśmy, że osoby z RO T1D miały lepszą zdolność do generowania funkcjonalnych zarówno iTregs, jak i namnażanych nTregs w porównaniu do osób z LS T1D oraz zdrowej grupy kontrolnej7. Zatem test ten może służyć jako doskonałe narzędzie do rozpoznawania zarówno wczesnego, jak i późnego stanu nierównowagi immunologicznej.
Schemat 1 Schematyczne przedstawienie etapów analizy supresji in vitro
<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="Przebieg sortowania komórek: powlekanie kulek, izolacja PBMC, MACS, FACS, hodowla in vitro, liczenie komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Etapy procesu in vitro test supresji przedstawiony za pomocą fotografii 
<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="Schematy cytometrii przepływowej; sortowanie komórek na podstawie analizy ekspresji CD25; wykresy FSC-A vs. PE-A." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Strategia bramkowania w izolacji komórek metodą FACS. a) Próg dla CD25+ został dostosowany zgodnie z kontrolą Fluorochrome Minus One (FMO), b) komórki zostały obramowane jako FITC-ujemne, c) komórki FITC-ujemne zostały następnie poddane dalszemu bramkowaniu i zebrane jako frakcje CD+CD25-, CD+CD25low oraz CD+CD25high (Tregs), przedstawione wraz z wartościami procentowymi, d) komórki Tregs po sortowaniu FACS, e) komórki CD+CD25low po sortowaniu FACS oraz f) komórki T CD4+CD25- po sortowaniu FACS
<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="Dane dotyczące supresji limfocytów T CD4+; wykresy słupkowe; porównanie podgrup CD25; wyniki badań immunologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rycina 3. Reprezentatywne wyniki zdrowych ochotników a) Reprezentatywne wyniki liczby impulsów na minutę (cpm) dla zdrowych ochotników, przedstawione jako pojedyncze hodowle dla wszystkich zaangażowanych subpopulacji komórek (naiwnych CD25-, in vivo aktywowany-CD25low, komórki prezentujące antygen-APC i limfocyty T regulatorowe-Treg), a także kokultury limfocytów T respondujących (CD25- lub CD25low) i limfocytów Treg. b) Procent supresji poszczególnych odpowiadających limfocytów T CD25- oraz CD25low przez autologiczne limfocyty T regulatorowe (Tregs) przedstawiono dla zdrowych osób z grupy kontrolnej (n=4). Supresję obliczono według wzoru [(s-c)/s] x 10%, gdzie s=cpm w monokulturze, a c=cpm w kokulturze. Mimo zauważenia niewielkiej różnicy w zdolności Tregs do supresji odpowiadających limfocytów T, nie była ona istotna statystycznie (parzysty test t, p=0,08). c) Przedstawiono wartości cpm dla osobników z grupy ryzyka dla każdej pojedynczej hodowli, w tym dla limfocytów T CD25- oraz CD25low jako komórek odpowiadających, a także dla APC i Tregów, oraz dla kokultur, w których każda subpopulacja odpowiadających limfocytów T została wysiana z Tregami (CD25-/Tregi oraz CD25low/Tregi). d) Procent supresji poszczególnych komórek T responderów CD25- oraz CD25low przez autologiczne Tregs przedstawiono dla osób z grupy ryzyka (n=4). Różnica w zdolności Tregs do supresji komórek T responderów CD25- w porównaniu z CD25low była istotna (test t dla prób zależnych p=0,04). 
Tabela 1. Schematyczny układ testu supresji in vitro
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>1-3</td>
			<td>4-6</td>
			<td>7-9</td>
			<td>10-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>CD4CD25-</td>
			<td>CD4CD25low</td>
			<td>sama wersja wideo</td>
			<td>same medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>CD4CD25- /Tregs</td>
			<td>CD4CD25low /Tregi</td>
			<td>wyłącznie limfocyty T regulatorowe (Tregs)</td>
			<td>wyłącznie APC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<ol><li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).</li>
<li>Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+arsenazo+III+in+the+preparation+and+characterization+of+an+albumin-linked%2C+gadolinium-based+macromolecular+magnetic+resonance+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent.</a> J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).</li>
<li>Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+determination+of+the+number+of+water+molecules%2C+q%2C+coordinated+to+europium%28III%29+ions+in+solution+from+luminescence+decay+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes.</a> Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).</li>
<li>Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-based+drug+and+imaging+conjugates%3A+design+considerations+for+nanomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications.</a> Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).</li>
<li>Que, E. L., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+as+chemical+sensors+for+metals+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).</li>
<li>Uppal, R., Caravan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+probes+for+cardiovascular+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeted probes for cardiovascular MR imaging.</a> Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).</li>
<li>Major, J. L., Meade, T. J. B. ioresponsive <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresponsive%2C+cell-penetrating%2C+and+multimeric+MR+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).</li>
<li>Datta, A., Raymond, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gd-hydroxypyridinone+%28HOPO%29-based+high-relaxivity+magnetic+resonance+imaging+%28MRI%29+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).</li>
<li>Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsive+MRI+agents+for+sensing+metabolism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo.</a> Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).</li>
<li>Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+containing+nanosized+systems+for+MR-molecular+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications.</a> Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).</li>
<li>Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gadolinium%28III%29+chelates+as+MRI+contrast+agents%3A+structure%2C+dynamics%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications.</a> Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).</li>
<li>Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging%3A+theory+and+design%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li>
<li>Yoo, B., Pagel, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).</li>
<li>Pandya, S., Yu, J., Parker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+emissive+europium+and+terbium+complexes+for+molecular+imaging+and+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Trans%22%5BJournal%5D)">Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing.</a> Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).</li>
<li>Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+in+the+preparation+of+dendrimer-based+bifunctional+diethylenetriaminepentaacetic+acid+MR+contrast+agent+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives.</a> Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).</li>
<li>Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+MRI+properties+between+derivatized+DTPA+and+DOTA+gadolinium-dendrimer+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).</li>
<li>Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li>
<li>Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li>
<li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+biological+evaluation+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23-targeted+PAMAM+dendrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Ponieważ funkcja supresyjna jest jedyną unikalną cechą limfocytów Tregs, powinna być ona badana w sposób niezawodny i jednolity pomiędzy osobnikami na różnych etapach rozwoju choroby, zarówno w ramach jednego badania, jak i pomiędzy różnymi badaniami. W ramach wkładu w standaryzację tej metody przedstawiamy szczegóły testu supresji opracowanego w naszym laboratorium. W szeroko zakrojonym badaniu optymalizacyjnym ustaliliśmy, że stymulacja limfocytów T za pomocą kulek powlekanych przeciwciałami anty-CD3 dla człowieka (klo...

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Amersham</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-1X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>mikrokulki anty-CD4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>Filtry wstępne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>kolumna LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD4 ludzkie APCCy7 (klon RPA-T4)</td><td>BD Biosciences</td><td>557852</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD25-PE (klon M-A251; IL-2R&amp;#945;)</td><td>BD Biosciences</td><td>555432</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD8 ludzkie znakowane FITC (klon RPA-T8)</td><td>BD Biosciences</td><td>555366</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD14 dla człowieka znakowane FITC (klon M5E2; receptor LPS)</td><td>BD Biosciences</td><td>555397</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkie CD32-FITC (klon FLI8.26; Fc&amp;#947;typu R-II)</td><td>BD Biosciences</td><td>555448</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD116 ludzkie-FITC (klon M5D12; GM-CSFR)&amp;#945; łańcuch)</td><td>BD Biosciences</td><td>554532</td><td></td></tr><tr><td>Dynalbeads M-450 aktywowane tosylowo</td><td>Invitrogen</td><td>140-13</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD3</td><td>Ancell</td><td>144-024</td><td></td></tr><tr><td>Bufor 1</td><td>Własnej produkcji</td><td></td><td>0,1 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt; pH 7,6</td></tr><tr><td>Bufor 2</td><td>Własnego wykonania</td><td></td><td>PBS/2mM EDTA/ 0,1% BSA pH 7,4</td></tr><tr><td>Bufor 3</td><td>Własnej roboty</td><td></td><td>0,2 M Tris/0,1% BSA pH 8,5</td></tr><tr><td>Kompletna pożywka RPMI</td><td>Własnego wyrobu</td><td></td><td>pożywka RPMI 1640 z 2 mM L-glutaminą, 5 mM HEPES i 100 U/&amp;#x03BC;g/ml penicyliny/streptomycyny, 0,5 mM pirogronianu sodu</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;[H]-tymidyna</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET027Z005MC</td><td></td></tr><tr><td>ludzka pulowana surowica grupy AB </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>Wieloekranowa płytka do zbiorów</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHFC1H60</td><td></td></tr><tr><td>Microscint 20</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013621</td><td></td></tr></tbody></table>

supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulacyjne limfocyty T (Tregs) są kluczowymi mediatorami tolerancji immunologicznej na autoantygeny. Ponadto pełnią one istotną rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej po infekcji. Mimo wysiłków zmierzających do zidentyfikowania unikalnego markera powierzchniowego dla Tregs, jedyną unikalną cechą jest ich zdolność do supresji proliferacji i funkcji efektorowych limfocytów T. Choć oczywiste jest, że do oceny funkcji ludzkich Tregs można stosować wyłącznie testy in vitro, staje się to problematyczne przy analizie wyników badań przekrojowych, w których konieczne jest porównanie komórek zdrowych z komórkami izolowanymi od osób z chorobami autoimmunologicznymi (takimi jak cukrzyca typu 1 – T1D). W laboratoriach występuje duża zmienność w liczbie i typie limfocytów T respondentów, charakterze i sile stymulacji, stosunkach Treg:respondent oraz liczbie i typie komórek prezentujących antygen (APC) wykorzystywanych w ludzkich testach supresji in vitro. Taka zmienność utrudnia porównywanie wyników między badaniami mierzącymi funkcję Tregs. W badaniach nad Tregs istnieje potrzeba opracowania standaryzowanego testu supresji, który będzie skuteczny zarówno w przypadku osób zdrowych, jak i pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi. Opracowaliśmy test supresji in vitro, który wykazuje bardzo niską zmienność wewnątrzanalizy w stymulacji limfocytów T izolowanych od zdrowych ochotników w porównaniu z osobami z autoimmunologiczną destrukcją komórek β trzustki. Głównym celem niniejszego opracowania jest opis ludzkiego testu supresji in vitro, który umożliwia porównania między różnymi grupami badawczymi. Dodatkowo test ten ma potencjał do wykrywania niewielkiego spadku funkcji nTreg i przewidywania dalszego ubytku w przyszłości, co pozwala na zidentyfikowanie osób, które mogłyby odnieść korzyść z zapobiegawczej terapii immunomodulującej1. Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis kroków zaangażowanych w tę procedurę. Mamy nadzieję przyczynić się do standaryzacji testu supresji in vitro stosowanego do pomiaru funkcji Tregs. Ponadto oferujemy ten test jako narzędzie do rozpoznawania wczesnego stanu nierównowagi immunologicznej oraz potencjalny biomarker funkcjonalny w T1D.

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Limfocyty T regulatorowe (Tregs) są kluczowymi mediatorami tolerancji immunologicznej na autoantygeny. Ponadto stanowią one istotne regulatory odpowiedzi immunologicznej...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie testu supresji in vitro dla ludzi do pomiaru funkcji komórek treg oraz potencjalnego przewidywania przyszłej utraty ich funkcji. Osiąga się to poprzez przygotowanie i przetestowanie zakodowanych kulek, które posłużą jako stymulatory komórkowe. Drugim krokiem jest izolacja czystych naiwnych limfocytów T CD4+ CD25-, aktywowanych in vivo limfocytów T CD4+ CD25low oraz regulatorowych limfocytów T CD4+ CD25high, a także napromieniowanych PBMC do wykorzystania jako komórki prezentujące antygen (APC).Następnie przygotowuje się monokultury naiwnych lub aktywowanych limfocytów T jako komórek respondujących z BMC P jako APC lub kokultury w tych samych warunkach, ale z dodatkiem treg w stosunku 1 do 10. Ostatnim krokiem jest zebranie komórek i pomiar ich proliferacji za pomocą wbudowywania trytowanej tymidyny. Otrzymane ostatecznie wyniki mogą wykazać różnice w supresji odpowiedzi naiwnych w porównaniu z aktywowanymi in vivo limfocytami T.Nazywam się Jeff Woodcliff. Limfocyty T regulatorowe nie wykazują unikalnych markerów powierzchniowych. Dlatego, aby wiarygodnie zmierzyć ich funkcję, muszą one zostać wyizolowane przy użyciu technik zapewniających najlepszą separację.Główną zaletą stosowania sortowania komórek aktywowanego fluorescencją w porównaniu z innymi metodami, takimi jak izolacja maksymalna, jest wysoka czystość uzyskiwanych populacji komórek. Funkcje komórek mogą być następnie wiarygodnie badane w testach supresji in vitro, co zostało tutaj zademonstrowane. Metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o funkcji komórek Treg u osób zdrowych oraz u pacjentów z cukrzycą typu pierwszego. Może być ona również zastosowana w przypadku innych chorób autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów u ludzi, toczeń rumieniowaty układowy, stwardnienie rozsiane i inne. W celu pokrycia kulek aktywowanych TAAL przeciwciałami anty-CD3 przeciwko ludzkim komórkom.Dodaj jeden mililitr kulek aktywowanych M four 50 toil z oryginalnej fiolki do probówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie umieść probówkę w statywie magnetycznym, aż wszystkie kulki przywrą do ścianki probówki. Następnie usuń bufor do kulek, odpipetowując go, gdy probówka wciąż znajduje się w statywie magnetycznym. Po tym wyjmij probówkę ze statywu magnetycznego i dodaj jeden mililitr buforu jeden.Wielokrotnie umieszczaj probówkę w statywie magnetycznym. Usuń bufor, gdy probówka znajduje się w statywie magnetycznym. Ponownie resuspenduj kuleczki w 1 ml buforu 1.Tym razem należy dodać również 40 µL przeciwciała anty-CD3 przeciwko ludzkim komórkom. Inkubować kuleczki z przeciwciałem przy 37 °C przez 15 minut. Następnie dodać 0,1% w/v BSA i kontynuować inkubację przez kolejne 16 godzin.Następnie dwa razy przemyj kuleczki buforem dwa, inkubując kuleczki w 1 ml buforu dwa przez 5 minut w temperaturze od 2 do 8 °C, a następnie usuwając bufor, gdy probówka znajduje się w statywie magnetycznym. Następnie przemyj kuleczki jeszcze raz w tych samych warunkach sterylnych.Tym razem, wykorzystując jeden mililitr buforu trzy, przetestuj wydajność powlekania przeciwciałami, dodając zmienną liczbę kulek powlekanych CD3 na komórkę, aby ustalić optymalny stosunek i ALI, dozując 50, 20, 5 000 PBMC na studzienkę w trzech powtórzeniach na płytce 96-dołkowej. Po 72 godzinach hodowli w temperaturze 37 °C dodaj jeden mikrokury tritiated thymidine i kontynuuj inkubację przez kolejne 16 godzin. Zbierz komórki do wielokanałowej płytki do zbioru lub podobnej.Dodaj ciecz scyntylacyjną i odczytaj liczbę zliczeń na minutę (CPM) dla każdej studzienki. Używając licznika scyntylacyjnego TopCount NX lub podobnego, wyznacz stosunek kulek do komórek; w naszym doświadczeniu najlepsze wyniki uzyskano, gdy CPM konsekwentnie przekraczało 5 000, ale było niższe niż 15 000. Stosunek trzech kulek na jedną komórkę zazwyczaj zapewnia optymalną stymulację zarówno dla komórek responderów, jak i komórek treg u wszystkich badanych osób.Napełnij 50-mililitrową probówkę stożkową 15 mililitrami fal plus. Następnie wykonaj rozcieńczenie w stosunku jeden do sześciu dla 50 mililitrów warstwy leukocytarnej (buffy coat), dodając 250 mililitrów PBS do probówki z krwią. Powoli nanieś 25 mililitrów rozcieńczonej warstwy leukocytarnej na wierzch fial pack, uważając, aby nie zmieszać warstw.Wiruj przy 800 ×g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przy wyłączonym hamowaniu ostrożnie zbierz warstwę PBMC, która stanowi białą fazę pośrednią między Ficoll a buforem. W razie potrzeby zeskrob komórki ze ścianek probówki.Odczekaj kilka minut, a następnie ponownie zbierz je z fazy pośredniej. Przenieś komórki do nowych probówek o pojemności 50 ml i przemyj je, wypełniając probówki buforem PBS, a następnie odwiruj osad. PBM cs.Powtórz etap płukania dwukrotnie w każdym przypadku. Połącz dwa osady komórkowe w jednej probówce, a ostatecznie wszystkie osady komórkowe w jednej probówce o pojemności 50 ml. Następnie użyj 20 µl zawiesiny komórek, aby ocenić żywotność komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego.W celu generowania APC przenieś 1 mL żywych pbmc do nowej probówki. Następnie dodaj 4 mL pożywki i napromieniuj komórki dawką 5 000 rad; probówkę zawierającą resztę pbmc uzupełnij buforem PBS. Po odwirowaniu komórek przy 250 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 4 mL tej samej mieszaniny.Następnie do PBMC dodaj 200 µL mikrokulek max anti CD4 i inkubuj mieszaninę komórek i kulek w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po inkubacji przemyj komórki 40 mL buforu PBS, a następnie odwiruj komórki. Zlej naddatek i resuspenduj komórki w 8 mL odgazowanego buforu PBS w temperaturze pokojowej.Następnie użyj filtrów do separacji wstępnej, aby odfiltrować zawiesinę komórkową. Następnie podziel PBM CS do dwóch probówek o pojemności 15 ml, dodając do każdej probówki 4 ml P BMCs.Przymocuj dwie kolumny do separatora minimax i umieść probówki do zbierania pod każdą kolumną. Następnie dodaj 3 mL buforu PBS DGAs do każdej kolumny. Gdy bufor zostanie całkowicie przepuszczony, nanieś całą 4 mL zawiesinę komórek z każdej probówki na kolumny, zanim zawiesina całkowicie wyschnie. Dodaj 3 mL buforu PBS DGAs w temperaturze pokojowej do każdej kolumny i pozwól, aby bufor przepłynął do probówek do zbierania.Dodawaj bufor, aż wypłukana ciecz stanie się przejrzysta. Pipetuj kolejne pięć mililitrów buforu DGAs na kolumny LS, a następnie wyjmij kolumny LS z separatora minimax. Umieść kolumny w nowych, sterylnych probówkach zbiorczych o pojemności 50 mililitrów.Pozwól wypłynąć połowie mililitra, a następnie powoli wypchnij pozostałą objętość, która wynosi około czterech mililitrów. Teraz połącz dwie frakcje dodatnie pod kątem CD4. Następnie dodaj do probówki do 50 mililitrów PBS i policz komórki po wirowaniu przy 400 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Resuspender komórki w dwóch mililitrach buforu PBS. Połączyć w jednej probówce przeciwciała przeznaczone do barwienia: anty-CD 14, CD 32, CD 16 oraz opcjonalnie anty-CD 4. Odjąć alikwot mieszaniny do zbarwienia probówki kontrolnej bez fluorochromu.Przygotować probówkę FMO, przenosząc 5 µL zawiesiny komórkowej z probówki do probówki do cytometrii przepływowej (fax tube) i barwiąc komórki 2 µL wcześniej przygotowanego koktajlu przeciwciał. Następnie dodać niebarwione komórki oraz kulek powlekanych mysią IgG, które zostaną zbarwione pojedynczym fluorochromem, do nowych oddzielnych probówek do cytometrii przepływowej w celu wykorzystania ich jako kontrole kompensacji podczas sortowania komórek. Następnie dodać 50 µL przeciwciała anty-human CD 25 PE do koktajlu, a następnie dodać koktajl do pozostałej zawiesiny komórkowej.Inkubuj probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po inkubacji komórek z koktajlem przeciwciał dodaj do nich bufor PBS, a następnie odwiruj je, aby uzyskać osad. Resuspenduj osad w buforze PBS do stężenia 10⁷ komórek/ml.Użyj probówki FMO do ustawienia progu sortowania komórek T wykazujących ekspresję CD 25. Stosując tę strategię bramkowania, najpierw ustaw bramkę wokół komórek negatywnych pod kątem fitoxydyny, aby wykluczyć komórki pozytywne, które obejmują monocyty, makrofagi i wszystkie pozostałe niebędące limfocytami T komórki CD 4 pozytywne, zgodnie z przedstawioną na tej figurze ilustracją. Na osobnym wykresie wyznacz bramki dla komórek T CD 25 negatywnych i CD 25 low oraz komórek treg CD 25 high, jak pokazano na tej figurze.Po przepływie i sortowaniu subpopulacji komórek, odwiruj probówki z zebranym materiałem, a następnie przechowuj limfocyty T w lodzie do momentu wysiewania. Oznakuj płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U zgodnie z tabelą. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej wprowadź 50 µL alikwotu kulek pokrytych CD3, obliczonych na stężenie trzech kulek na jedną komórkę respondenta na dołek, w pełnym medium z 10% pulą surowicy AB człowieka, a następnie rozcieńcz wcześniej napromieniowane APC w medium do stężenia 5×10⁵ komórek/mL.Dodaj 50 µL komórek do płytki 96-dołkowej, a następnie dodaj 2,5 × 10⁴ komórek T CD4+ CD25- lub CD4+ CD25 low do każdego dołka w trzech powtórzeniach. Dodaj Tregs do rzędu B oraz do dołków oznaczonych jako „tylko Tregs” do kokultury w stosunku 1:10, zgodnie z przedstawionym schematem. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 i nasyconą wilgotnością przez 72 godziny. W dalszej kolejności przeprowadź puls komórek 1 µCi tymidyny trytowanej, a następnie kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C przez kolejne 16 godzin, aby tymidyna została wbudowana w ostatnich kilku godzinach kokultury.Użyj urządzenia filter mate harvester do zebrania komórek z wieloekranowej płytki do zbioru. Następnie przykryj płytkę do zbioru przezroczystą plastikową pokrywką, którą wcześniej wypełniono płynem scyntylacyjnym. Na koniec odczytaj wartość CPM dla każdej studzienki.Za pomocą licznika scyntylacyjnego w tym systemie można wyizolować subpopulacje limfocytów T o wysokiej czystości, co przedstawiono na poniższej serii wykresów kropkowych. Tutaj, w dolnej bramce, pokazano limfocyty T CD4-dodatnie i CD25-ujemne. Na kolejnej rycinie widoczne są wysokoczyste limfocyty T CD4-dodatnie i CD25-niskie. Czysta populacja CD4-dodatnich limfocytów sortowanych metodą przepływową.Komórki treg z wysoką ekspresją CD 25 są widoczne w górnej bramce kontrolnej. Hodowle pojedynczych typów komórek APC i treg od zdrowych dawców wykazały niewielką lub żadną proliferację ponad poziom tła, mierzona poprzez wbudowywanie tymidyny, podczas gdy naiwne komórki T CD 25 negatywne oraz aktywowane in vivo komórki T CD 25 niskie wykazały wyraźną proliferację, która jest hamowana, gdy te typy komórek odpowiadających są współhodowane z komórkami treg. Zaobserwowano jednak niewielkie różnice w zdolności komórek treg do supresji naiwnych komórek T CD 25 negatywnych oraz aktywowanych in vivo komórek T CD 25 niskich.Kontrola nie była istotna. Monokultury jednego typu komórek APC i Treg pochodzące od osób z grupy ryzyka wykazały niewielką lub żadną proliferację powyżej tła, mierzoną włączeniem tymidyny. Natomiast naiwne komórki CD 25 negatywne oraz aktywowane in vivo komórki CD 25 niskie wykazały niższe poziomy proliferacji w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych.Limfocyty T respondery zostały dodatkowo stłumione przez tregi i kokultury, ponieważ test generuje wiarygodne wyniki. Można dodatkowo wywnioskować, że niskie wartości CPM sugerują potencjalne defekty w transdukcji sygnału, co powinno zostać poddane dalszym badaniom w innym typie analizy. Różnica w zdolności tregów do supresji limfocytów T responderów CD 25 negatywnych w porównaniu do CD 25 niskich u osób z grupy ryzyka była jednak istotna.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak płynnie połączyć wszystkie niezbędne kroki, aby przeprowadzić skuteczny i wiarygodny test funkcjonalny obecności Tregs u osób zdrowych oraz u osób z upośledzonym układem odpornościowym, na przykład u osób z cukrzycą typu pierwszego.

human-vitro-suppression-as-screening-tool-for-recognition-an-early

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Człowiek In Vitro Supresja jako narzędzie przesiewowe do rozpoznania wczesnego stanu dysfunkcji układu odpornościowego

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Opisujemy użycie przeciwciał monoklonalnych TG30 (CD9) i GCTM-2 do połączonego wykrywania antygenów powierzchniowych komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do identyfikacji i wzbogacania żywych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) za pomocą selekcji pozytywnej, a także użycie selekcji negatywnej do usuwania hESC z populacji komórek mieszanych.

Wzbogacanie i oczyszczanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez wykrywanie antygenów powierzchniowych komórek przy użyciu przeciwciał monoklonalnych TG30 i GCTM-2

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Opisujemy ludzką komórkę jednojądrzastą krwi obwodowej (PBMC) — humanizowany model myszy ksenoprzeszczepu do translacyjnych badań immunoonkologicznych. Protokół ten może służyć jako ogólna wskazówka do ustanawiania i charakteryzowania podobnych modeli oceny terapii I-O.

Humanizowany model ksenoprzeszczepu z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) do badań immunoonkologicznych translacyjnych (I-O)

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Prezentowany tutaj jest protokół pierwotnej izolacji monocytów ludzkiej krwi, jak również ich różnicowania na makrofagi i komórki dendrytyczne oraz łączenia z komórkami nabłonkowymi w wielokomórkowy model ludzkiego płuca. Porównano reakcje biologiczne kokultur złożonych z komórek odpornościowych zróżnicowanych ze świeżo wyizolowanych lub rozmrożonych monocytów, po ekspozycji na bodźce prozapalne.

Wielokomórkowy model wyrostka zębodołowego człowieka złożony z komórek nabłonka i pierwotnych komórek odpornościowych do oceny zagrożeń

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Poznaj zoptymalizowaną metodę in vitro do oceny funkcji komórek Treg i identyfikacji ryzyka cukrzycy typu 1. Ta technika umożliwia wczesne wykrywanie nierównowagi immunologicznej u osób zagrożonych.

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Przeglądaj więcej filmów