Supresja in vitro u ludzi jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu nierównowagi immunologicznej

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie testu supresji u ludzi in vitro do pomiaru funkcji limfocytów Treg i potencjalnego przewidywania przyszłych strat w ich funkcji. Osiąga się to poprzez przygotowanie i przetestowanie zakodowanych kulek, które będą używane jako stymulatory komórek. Drugim krokiem jest wyizolowanie czystych naiwnych limfocytów T CD 4 dodatnich CD 25 ujemnych in vivo aktywowanych CD czterech dodatnich, CD 25 o niskiej zawartości komórek T i regulatorowych CD czterech dodatnich limfocytów T CD 25 o wysokiej zawartości N do promieniowania PP BMC do wykorzystania jako komórki prezentujące antygen lub APC.

Następnie tworzy się pojedyncze hodowle naiwnych lub aktywowanych limfocytów T jako reagujących z P BMC jako APC lub hodowlami koaktywnymi w tych samych warunkach, ale z dodanymi tregami w stosunku 1 do 10. Ostatnim krokiem jest pobranie komórek i zmierzenie ich proliferacji poprzez tritiated. Ostatecznie uzyskane wyniki inkorporacji tymidyny mogą wykazać różnice w tłumieniu naiwnych i aktywowanych in vivo odpowiedzi limfocytów T.

Nazywam się Jeff Woodcliff. Limfocyty T regulatorowe nie wyrażają unikalnych markerów powierzchni komórek. Dlatego, aby wiarygodnie zmierzyć ich funkcję, należy je odizolować za pomocą technik zapewniających najlepszą separację.

Główną zaletą stosowania sortowania komórek aktywowanego fluorescencją w porównaniu z innymi metodami, takimi jak maksymalna izolacja, jest to, że faks oferuje czyste populacje komórek, które można uzyskać. Funkcja komórki może być następnie wiarygodnie przetestowana w testach supresji in vitro, jak pokazano tutaj. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w funkcję treg u osób zdrowych i związanych z cukrzycą typu pierwszego. Może być również stosowany w innych chorobach autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów u ludzi, toczeń układowy, mitoza ery, stwardnienie rozsiane i inne Aby pokryć kulki aktywowane taal anty-ludzkim CD trzy.

Dodaj jeden mililitr kulek aktywowanych M four 50 toil z oryginalnej fiolki do 1,5 mililitrowej probówki i umieść probówkę w stojaku magnetycznym, aż wszystkie kulki przylgną do boku probówki. Następnie wyjmij bufor kulkowy, pipetując go, gdy probówka nadal znajduje się w stojaku magnetycznym. Następnie wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj jeden mililitr buforu.

Umieść rurkę w stojaku magnetycznym raz za razem. Wyjmij bufor, gdy rurka znajduje się w stojaku magnetycznym. Resus, ponownie zawieś kulki w jednym mililitrze bufora.

Tym razem dodając również 40 mikrolitrów anty-ludzkiej płyty CD 3. Mieszaj kulki i przeciwciało w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodać 0,1% masy na objętość BS, A i kontynuować mieszanie przez następne 16 godzin.

Następnie umyj kulki dwukrotnie buforem drugim, inkubując kulki w jednym mililitrze buforu. Dwa przez pięć minut w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, a następnie wyjęcie buforu, gdy rurka znajduje się w stojaku magnetycznym. Następnie umyj koraliki jeszcze raz w tych samych sterylnych warunkach.

Tym razem używając jednego mililitra buforu trzeciego, przetestuj skuteczność powłoki przeciwciała, dodając zmienną liczbę trzech powlekanych kulek CD na komórkę w celu określenia optymalnego stosunku i ALI podając 50 020 5 000 P BMC na studzienkę w trzech egzemplarzach na płytce 96 kulek. Po 72 godzinach w kulturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj jedno mikro curry tritiated thymidine i kontynuuj inkubację przez następne 16 godzin. Zbierz komórki na wielositowej płycie do zbioru lub podobnej.

Dodaj płyn scyntylacyjny i odczytaj liczbę na minutę lub CPM na studzienkę. Korzystając z licznika scyntylacyjnego N XT o największej liczbie lub podobnego, określ stosunek ściegów do komórek, używając tego, który daje CPM stale powyżej 5 000, ale mniej niż 15 000 z naszego doświadczenia. Stosunek trzech kulek na komórkę zwykle zapewnia optymalną stymulację zarówno dla komórek reagujących, jak i treg u wszystkich badanych ludzi.

Napełnij 50-mililitrową rurkę stożkową 15 mililitrami fal plus. Następnie wykonaj rozcieńczenie od jednego do sześciu 50 mililitrów kożucha kożuchowego, dodając 250 mililitrów PBS do probówki z krwią. Powoli nałóż 25 mililitrów rozcieńczonej kożuchy na wierzch opakowania fial, nie naruszając warstw.

Wirować w temperaturze 800 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przy wyłączonej przerwie ostrożnie zebrać warstwę PBMC, która jest białą fazą pośrednią między fialem a buforem. W razie potrzeby zeskrob komórki ze ścianki rurki.

Odczekaj kilka minut i zbierz je ponownie z fazy pośredniej. Przenieś komórki do świeżych 50-mililitrowych probówek i umyj je, wypełniając probówki granulkami PBS. Plik PBM cs.

Za każdym razem powtórz krok prania dwa razy. Łącząc dwa granulki komórkowe w jedną tubę, ostatecznie połącz wszystkie granulki komórkowe w jedną rurkę o pojemności 50 mililitrów. Następnie użyj 20 mikrolitrów zawieszonych komórek, aby określić żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trianowego.

Przetestuj generowanie APC, przenosząc jeden mililitr żywotnego pbmc do nowej probówki. Następnie dodać cztery mililitry pożywki i napromienić komórki 5 000 radów, uzupełnić probówkę zawierającą resztę P BMC buforem PBS. Następnie po wirowaniu komórek w temperaturze 250 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odlej supernatant i ponownie zawieś komórki w czterech mililitrach tej samej domieszki.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów max anty CD cztery mikrogranulki do pbmc i inkubuj mieszaninę komórek i kulek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji umyj komórki w 40 mililitrach buforu PBS, a następnie zagnieźdź komórki. Następnie odlewać supernatant i ponownie zawisnąć komórki w ośmiu mililitrach buforu Degas PBS w temperaturze pokojowej.

Następnie użyj filtrów separacji wstępnej, aby odfiltrować zawiesinę komórek. Następnie podziel PBM CS na dwie 15-mililitrowe tubki. Dodanie czterech mililitrów P BMC do każdej probówki.

Gruby przymocuj dwie kolumny s do separatora minimax i umieść probówki zbiorcze poniżej każdej kolumny. Następnie dodaj trzy mililitry buforu PBS DGA do każdej kolumny, gdy nie pozostał żaden bufor, ułóż warstwę całego czteromililitrowego roztworu komórkowego z każdej probówki na kolumnach, zanim zawiesina komórek całkowicie się wyczerpie. Dodaj trzy mililitry buforu PBS DGA o temperaturze pokojowej do każdej kolumny i pozwól buforowi przepłynąć do probówek zbiorczych.

Dodaj więcej bufora, aż wyjdzie czysty. Odpipetować pięć dodatkowych mililitrów buforu DGA na kolumny LS, a następnie usunąć kolumny LS z separatora minimax. Umieść kolumny w nowych sterylnych probówkach zbiorczych o pojemności 50 mililitrów.

Niech skończy się pół mililitra, a następnie powoli zanurz resztę objętości, czyli około czterech mililitrów. Teraz połącz dwie CD cztery frakcje dodatnie. Następnie dodaj do 50 mililitrów PBS do probówki i policz komórki po obracaniu komórek pod kątem 400 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach buforu PBS. Połączyć przeciwciała, które mają być użyte do barwienia faktów, w jednej probówce anty CD 14, CD 32, CD one 16 i opcjonalnie anty CD 4. Weź podwielokrotność mieszaniny do barwienia FLUOROCHROMU minus jedna probówka.

Przygotować probówkę FMO, przenosząc pięć mikrolitrów probówki zawiesiny komórek mililitrowych do probówki faksowej i zabarwić komórki dwoma mikrolitrami wcześniej przygotowanego koktajlu przeciwciał. Następnie, dodać niebarwione komórki i koraliki pokryte mysią IgG, które mają być wybarwione pojedynczym fluorochromem, do nowych pojedynczych probówek faksowych w celu użycia jako kontrole kompensacyjne do sortowania komórek. Następnie dodaj 50 mikrolitrów anty-ludzkiego CD 25 PE do koktajlu i dodaj koktajl do reszty zawiesiny komórkowej.

Inkubować probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji komórek z koktajlem przeciwciał dodaj bufor PBS do komórek, a następnie zagnieźdź je Resus. Zawiesić osad w buforze PBS w stężeniu od 10 do siedmiu komórek na mililitr przyponu.

Użyj probówki FMO, aby ustawić próg sortowania dodatnich limfocytów T CD 25. Korzystając z tej strategii bramkowania, najpierw ustaw chód wokół komórek fite ujemnych, aby wykluczyć komórki fitz dodatnie, które obejmują monocyty, makrofagi i wszystkie inne CD four dodatnie komórki T nie-T, jak pokazano na tym rysunku. Na osobnym wykresie narysuj chody dla CD 25 ujemnych i CD 25 niskich limfocytów T oraz CD 25 wysokich komórek Treg, jak na tym rysunku.

Po przepływie, posortowaniu podzbiorów komórek, zagnieźdź probówki zbiorcze, a następnie trzymaj komórkę T na lodzie do czasu posiewu. Oznacz dolną płytkę 96-dołkową w kształcie litery U, jak pokazano w tabeli. Zawiesić 50-mikrolitrową porcję trzech powlekanych kulek CD, obliczoną na stężenie trzech kulek na komórkę odpowiadającą na studzienkę w kompletnym pożywce z 10% zebraną ludzką surowicą AB na płytce 96-dołkowej, a następnie rozcieńczyć wcześniej napromieniowane APC w pożywce do stężenia pięć razy 10 do piątej komórki na mililitr.

Dodać 50 mikrolitrów komórek do płytki 96-dołkowej, a następnie dodać 2,5 razy 10 do czterech CD cztery dodatnie CD 25 ujemne lub CD cztery dodatnie CD 25 niskie limfocyty T na dołek w trzech powtórzeniach, dodać tregi do rzędu B i do studzienek oznaczonych jako tregi tylko kokultury w stosunku jeden do 10, jak pokazano tutaj. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% CO2 w wilgotności nasyconej przez 72 godziny. Następnie poddaj komórki pulsacji jednym mikrokiurem tritiated thymidine, a następnie kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez następne 16 godzin po włączeniu tymidyny w ciągu ostatnich kilku godzin kohodowli.

Użyj kombajnu do zbierania materiałów filtracyjnych, aby zebrać komórki na wielositowej płycie zbiorczej. Następnie przykryj talerz zbiorczy przezroczystą plastikową osłoną uprzednio wypełnioną płynem scyntylacyjnym. Na koniec odczytaj CPM na studnię.

Korzystając z licznika scyntylacyjnego, podzbiory limfocytów T można wyizolować do wysokiej czystości za pomocą tego systemu, jak widać w następującej serii wykresów punktowych: CD cztery dodatnie limfocyty T CD 25 ujemne są pokazane tutaj w dolnej bramce. Na następnym rysunku można zobaczyć wysoce oczyszczone CD cztery dodatnie limfocyty T CD 25 o niskiej wartości. Czysta populacja posortowana przepływowo CD cztery dodatnie.

Komórki CD 25 o wysokim treg są pokazane w kontrolce górnej bramki. Hodowle pojedynczych typów komórek APC i treg od zdrowych osób wykazywały niewielką lub żadną proliferację na tle, mierzoną przez włączenie tymidyny, podczas gdy naiwne ujemne CD 25 i aktywowane in vivo limfocyty CD 25 o niskiej zawartości T wykazywały wyraźną proliferację, która jest tłumiona, gdy te typy komórek reagujących są hodowane jednocześnie z komórkami Treg. Chociaż zaobserwowano niewielkie różnice w zdolności tregów do tłumienia nieprawidłowych limfocytów T CD 25 nieżyjących i aktywowanych in vivo CD 25 o niskim poziomie.

Nie była to znacząca kontrola. Hodowle pojedynczych typów komórek APC i Treg od osób z grupy ryzyka wykazywały niewielką lub żadną proliferację na tle, mierzoną przez włączenie tymidyny. Podczas gdy naiwne limfocyty T CD 25 ujemne i aktywowane InVivo CD 25 wykazywały niższy poziom proliferacji w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej.

Limfocyty T reagujące były dalej tłumione przez hodowle tregów i ko, ponieważ test daje wiarygodne wyniki. Możemy dodatkowo stwierdzić, że niskie wartości CPM sugerują potencjalne defekty w transdukcji sygnału, które powinny być dalej badane w innym typie badania. Różnica w zdolności tregów do tłumienia limfocytów T o niskiej odpowiedzi CD 25 w porównaniu z limfocytami T o niskiej odpowiedzi na CD 25 u osób z grupy ryzyka była jednak znacząca.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak płynnie połączyć wszystkie niezbędne kroki, aby uzyskać udany i wiarygodny test funkcjonalny na obecność Treg u zdrowych osób i osób z osłabionym układem odpornościowym. Na przykład u osób z cukrzycą typu pierwszego.