Suprasja immunologiczna człowieka in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu nierównowagi immunologicznej

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie in vitro testu supresji ludzkiej do pomiaru funkcji komórek treg oraz potencjalnego przewidywania przyszłej utraty ich funkcji. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie i przetestowanie zakodowanych kulek, które posłużą jako stymulatory komórkowe. Drugim krokiem jest izolacja czystych naiwnych limfocytów T CD4+ CD25-, limfocytów T aktywowanych in vivo CD4+ CD25low oraz regulacyjnych limfocytów T CD4+ CD25high, a także napromieniowanych BMC z PP do wykorzystania jako komórki prezentujące antygen (APC).

Następnie przygotowuje się monokultury naiwnych lub aktywowanych limfocytów T jako komórek odpowiadających z BMC pacjenta jako APC lub kokultury w tych samych warunkach, ale z dodatkiem komórek treg w stosunku 1:10. Ostatnim krokiem jest zebranie komórek i pomiar ich proliferacji za pomocą wbudowywania trytylowanej tymidyny. Uzyskane ostatecznie wyniki mogą wykazać różnice w supresji odpowiedzi naiwnych i aktywowanych in vivo limfocytów T.

Nazywam się Jeff Woodcliff. Limfocyty T regulatorowe nie wykazują unikalnych markerów powierzchniowych. Dlatego, aby wiarygodnie zmierzyć ich funkcję, muszą one zostać wyizolowane przy użyciu technik zapewniających najlepszą separację.

Główną zaletą zastosowania fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) w porównaniu z innymi metodami, takimi jak izolacja maksymalna, jest możliwość uzyskania wysokiej czystości populacji komórkowych. Dzięki temu funkcje komórek mogą być wiarygodnie testowane w testach supresji in vitro, co zostało tutaj zademonstrowane. Metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w funkcję komórek Treg u osób zdrowych oraz u pacjentów z cukrzycą typu 1. Może ona zostać zastosowana również w przypadku innych chorób autoimmunologicznych, takich jak ludzkie reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty układowy, stwardnienie rozsiane i inne. W celu powlekania kulek aktywacyjnych anti-human CD3.

Przenieś jeden mililitr kulek M four 50 toil activated z oryginalnej fiolki do probówki o pojemności 1,5 mililitra i umieść probówkę w statywie magnetycznym, aż wszystkie kulki przywrą do ścianki probówki. Następnie usuń bufor do kulek, odsysając go pipetą, gdy probówka wciąż znajduje się w statywie magnetycznym. Po tym wyjmij probówkę ze statywu magnetycznego i dodaj jeden mililitr buforu jeden.

Wielokrotnie umieszczaj probówkę w statywie magnetycznym. Usuwaj bufor, gdy probówka znajduje się w statywie magnetycznym. Ponownie resuspenduj kuleczki w 1 mL buforu 1.

Tym razem należy dodać również 40 µL przeciwciał anty-CD3 przeciwko ludzkiim białkom. Inkubować kuleczki z przeciwciałem przy 37 °C przez 15 minut, stale mieszając. Następnie dodać 0,1% w/v BSA i kontynuować mieszanie przez kolejne 16 godzin.

Następnie dwa razy przemyj kuleczki buforem dwa, inkubując je w 1 ml buforu dwa przez 5 minut w temperaturze od 2 do 8 °C, a następnie usuwając bufor, gdy probówka znajduje się w statywie magnetycznym. Po tym przemyj kuleczki jeszcze raz w tych samych warunkach sterylności.

Tym razem, używając jednego mililitra buforu trzy, należy przetestować wydajność powlekania przeciwciałami, dodając zmienną liczbę kulek powlekanych CD3 na komórkę, aby określić optymalny stosunek, nakładając 50 000 PBMC na dołek w trzech powtórzeniach na płytce 96-dołkowej. Po 72 godzinach hodowli w temperaturze 37 °C należy dodać 1 µCi tritylowanej tymidyny i kontynuować inkubację przez kolejne 16 godzin. Komórki należy zebrać do wielokanałowej płytki do zbioru lub podobnej.

Dodać płyn scyntylacyjny i odczytać liczbę zliczeń na minutę (CPM) dla każdej dołki. Korzystając z licznika scyntylacyjnego TopCount NXT lub podobnego, określić stosunek kulek do komórek; w naszym doświadczeniu optymalny wynik to taki, który konsekwentnie daje wartość CPM powyżej 5 000, ale poniżej 15 000. Stosunek trzech kulek na jedną komórkę zazwyczaj zapewnia optymalną stymulację zarówno dla komórek responderów, jak i komórek Treg u wszystkich przebadanych osób.

Napełnić probówkę stożkową o pojemności 50 ml ilością 15 ml Fipack Plus. Następnie wykonać rozcieńczenie 1:6 z 50 ml warstwy leukocytowej (buffy coat), dodając 250 ml PBS do probówki z krwią. Powoli nanieść 25 ml rozcieńczonej warstwy leukocytowej na wierzch Fipack, uważając, aby nie zmieszać warstw.

Wiruj próbkę przy 800 ×g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przy wyłączonym hamulcu ostrożnie pobierz warstwę PBMC, która stanowi białą fazę pośrednią między Ficoll a buforem. W razie potrzeby zeskrob komórki ze ścianek probówki.

Odczekaj kilka minut i ponownie pobierz je z fazy pośredniej. Przenieś komórki do nowych probówek o pojemności 50 ml i przemyj je, napełniając probówki PBS, a następnie odwiruj osad. PBM cs.

Powtórz etap płukania dwukrotnie w każdym przypadku. Połącz dwa osady komórkowe w jednej probówce, aż ostatecznie wszystkie osady komórkowe znajdą się w jednej probówce o pojemności 50 ml. Następnie pobierz 20 µL zawiesiny komórek, aby określić żywotność komórek metodą wykluczania trypanina blue.

Przygotuj testowe APC, przenosząc jeden mililitr żywych PBMC do nowej probówki. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki i naświetl komórki dawką 5 000 rad, a probówkę zawierającą pozostałe PBMC dopełnij buforem PBS. Po odwirowaniu komórek z prędkością 250 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w czterech mililitrach tej samej mieszaniny.

Następnie dodaj 200 µL mikrokulek anty-CD4 Max do PBMC i inkubuj mieszaninę komórek i kulek w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po inkubacji przemyj komórki w 40 ml buforu PBS, a następnie odwirowuj komórki. Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 8 ml odgazowanego buforu PBS w temperaturze pokojowej.

Następnie należy użyć filtrów do separacji wstępnej w celu odfiltrowania zawiesiny komórkowej. Potem rozdzielić PBM CS do dwóch probówek o pojemności 15 ml, dodając po 4 ml P BMCs do każdej z nich.

Przymocuj dwie kolumny do separatora minimax i umieść probówki do zbierania pod każdą z kolumn. Następnie dodaj 3 mL buforu PBS DGAs do każdej kolumny. Gdy bufor zostanie całkowicie zużyty, nanieś całą 4 mL roztwór komórek z każdej probówki na kolumny, zanim zawiesina komórkowa całkowicie wyschnie. Dodaj 3 mL buforu PBS DGAs w temperaturze pokojowej do każdej kolumny i pozwól, aby bufor przepłynął do probówek do zbierania.

Dodawaj bufor, aż roztwór stanie się klarowny. Pipetuj kolejne pięć mililitrów buforu DGAs na kolumny LS, a następnie wyjmij kolumny LS z separatora minimax. Umieść kolumny w nowych, sterylnych probówkach zbiorczych o pojemności 50 mililitrów.

Pozwól wypłynąć połowie mililitra, a następnie powoli wypchnij resztę objętości, która wynosi około czterech mililitrów. Teraz połącz dwie frakcje pozytywne pod względem CD4. Następnie dodaj do probówki do 50 mililitrów PBS i policz komórki po wirowaniu ich przy 400 ×g przez 10 minut w temperaturze 4°C.

Resuspender komórki w dwóch mililitrach buforu PBS. Połączyć przeciwciała przeznaczone do barwienia w jednej probówce: anty-CD 14, CD 32, CD 16 oraz opcjonalnie anty-CD 4. Odbiór niewielkiej ilości mieszaniny do barwienia probówki kontrolnej bez fluorochromu.

Przygotuj probówkę FMO, przenosząc 5 µL zawiesiny komórkowej z probówki do probówki do cytometrii przepływowej (fax tube) i barwiąc komórki 2 µL wcześniej przygotowanego koktajlu przeciwciał. Następnie, w celu uzyskania kontroli kompensacji do sortowania komórek, do nowych, oddzielnych probówek do cytometrii przepływowej dodaj niebarwione komórki oraz kuleczki pokryte mysim IgG, które zostaną zabarwione pojedynczym fluorochromem. Następnie dodaj 50 µL przeciwciała anty-CD25 PE do koktajlu, a następnie dodaj koktajl do pozostałej części zawiesiny komórkowej.

Inkubować probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po inkubacji komórek z koktajlem przeciwciał, dodać do komórek bufor PBS, a następnie je odwirować. Zawiesinę z osadu resuspendować w buforze PBS do stężenia 10⁷ komórek/ml.

Użyj probówki FMO do ustawienia progu sortowania komórek T CD25-dodatnich. Stosując tę strategię bramkowania, najpierw ustaw bramkę wokół komórek Fitc-ujemnych, aby wykluczyć komórki Fitc-dodatnie, w skład których wchodzą monocyty, makrofagi oraz wszystkie pozostałe nie-T komórki CD4-dodatnie, jak pokazano na tej figurze. Na oddzielnym wykresie wyznacz bramki dla komórek T CD25-ujemnych, komórek T z niską ekspresją CD25 oraz komórek treg z wysoką ekspresją CD25, zgodnie z tą figurą.

Po przeprowadzeniu analizy przepływowej i sortowaniu subpopulacji komórek, odwiruj probówki z materiałem, a następnie przechowuj limfocyty T w lodzie do momentu wysiania. Oznacz płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U zgodnie z tabelą. W płytce 96-dołkowej zawieś w pełnym medium z dodatkiem 10% puli ludzkiej surowicy AB aliquot 50 µL kulek powlekanych CD3, przeliczony na stężenie trzech kulek na komórkę respondora na dołek, a następnie rozcieńcz wcześniej napromieniowane APC w medium do stężenia 5 × 10⁵ komórek/mL.

Do płytki 96-dołkowej nanieś 50 µL zawiesiny komórek, a następnie dodaj 2,5 × 10⁴ komórek T CD4+ CD25- lub CD4+ CD25low do każdego dołka w trzech powtórzeniach. Do rzędu B oraz do dołków oznaczonych jako Tregs only dodaj komórki Treg w stosunku 1:10 do kokultury, zgodnie z przedstawionym schematem. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 i nasyconą wilgotnością przez 72 h. Kolejnym krokiem jest pulsacyjne podanie komórkom 1 µCi tymidyny trytylowanej, a następnie kontynuowanie inkubacji w temperaturze 37 °C przez następne 16 h, aby umożliwić wbudowanie tymidyny w ostatnich godzinach kokultury.

Użyj urządzenia Filter Mate Harvester do zbioru komórek z wieloekranowej płytki do zbioru. Następnie przykryj płytkę do zbioru przezroczystą plastikową pokrywką, która została wcześniej napełniona płynem scyntylacyjnym. Na koniec odczytaj wartość CPM dla każdej studni.

Za pomocą licznika scyntylacyjnego możliwe jest wyizolowanie subpopulacji limfocytów T o wysokiej czystości w tym systemie, co obrazuje poniższa seria wykresów kropkowych; tutaj w dolnej bramce przedstawiono limfocyty T CD4-dodatnie CD25-ujemne. Na kolejnej figurze widoczne są wysoce oczyszczone limfocyty T CD4-dodatnie CD25-low. Czysta populacja limfocytów CD4-dodatnich wyselekcjonowanych metodą sortowania przepływowego.

Komórki treg z wysoką ekspresją CD 25 są widoczne w górnej bramce kontrolnej. Hodowle monokulturowe APC i treg pochodzących od zdrowych dawców wykazały niewielką lub żadną proliferację powyżej tła w pomiarze wbudowywania tymydyny, natomiast naiwne komórki T CD 25-ujemne oraz aktywowane in vivo komórki T CD 25-niskie wykazały wyraźną proliferację, która zostaje zahamowana w przypadku kokultury tych typów komórek odpowiadających z komórkami treg. Zaobserwowano niewielkie różnice w zdolności treg do supresji naiwnych komórek T CD 25-ujemnych oraz aktywowanych in vivo komórek T CD 25-niskich.

Kontrola nie była istotna. Hodowle pojedynczych typów komórek APC i Treg pochodzące od osób z grupy ryzyka wykazały niewielką lub żadną proliferację ponad poziom tła, mierzoną poprzez włączenie tymidyny. Natomiast naiwne komórki T CD25- oraz aktywowane in vivo komórki T CD25low wykazały niższy poziom proliferacji w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych.

Limfocyty T respondera zostały dodatkowo zahamowane przez limfocyty treg oraz w kokulturach, ponieważ badanie dostarcza wiarygodnych wyników. Można dodatkowo wywnioskować, że niskie wartości CPM sugerują potencjalne defekty w transdukcji sygnału, co powinno zostać poddane dalszej analizie w innym rodzaju badania. Różnica w zdolności limfocytów treg do supresji limfocytów T respondera CD 25 negatywnych w porównaniu do CD 25 low u osób z grupy ryzyka była jednak istotna.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak płynnie połączyć wszystkie niezbędne etapy, aby przeprowadzić skuteczny i wiarygodny test funkcjonalny obecności komórek Tregs u zdrowych ochotników oraz u osób z upośledzonym układem odpornościowym, na przykład u pacjentów z cukrzycą typu pierwszego.