Ustalenie modelu infekcji poprzez mikroiniekcję organoidów żołądkowych z bakteriami chorobotwórczymi

Pod mikroskopem stereoskopowym obserwuj organoidy żołądka, trójwymiarowe struktury komórkowe złożone ze zróżnicowanych komórek żołądka i komórek macierzystych.

Wprowadzić mikrowstrzykiwacz wypełniony Helicobacter pylori, patogenem żołądka.

Wprowadzić igłę do docelowego organoidu i wstrzyknąć zawiesinę bakteryjną.

Obserwuj, jak w świetle rozwija się mętny roztwór.

H. pylori wykorzystuje specyficzne białko adhezyny na swojej powierzchni, które wiąże się z receptorem komórek żołądka, ustanawiając stabilną interakcję między bakteriami a komórkami gospodarza.

Ta interakcja wyzwala wydłużenie pilusa wydzielinowego bakterii, dużej struktury w kształcie tunelu, która rozciąga się w kierunku błony komórkowej gospodarza.

H. pylori wykorzystuje pilus wydzielniczy do wstrzykiwania czynników wirulencji, w tym genu A lub CagA związanego z cytotoksycznością, do komórki gospodarza.

Po wejściu do komórki CagA ulega fosforylacji przez kinazę komórki gospodarza.

Fosforylowany CagA rozregulowuje wiele wewnątrzkomórkowych kaskad sygnałowych, które zmieniają funkcje komórek gospodarza, sprzyjając transformacji nowotworowej.

Zbierz zainfekowane organoidy do dalszej analizy.

Aby rozpocząć mikroiniekcję organoidów, należy zebrać bakterie H. pylori i umyć je w podłożu podstawowym zgodnie ze standardowymi protokołami. Po pomiarach gęstości optycznej w celu określenia liczby bakterii, rozcieńczyć kulturę do 1 x 10⁹ bakterii na mililitr w pożywce podstawowej.

Za pomocą ściągacza do mikropipet wciągnąć szklaną kapilę do dwóch igieł iniekcyjnych i przechowywać na czystej szalce Petriego. Następnie za pomocą kleszczyków złamij końcówkę jednej igły do wstrzykiwań, aby uzyskać otwór o szerokości około 10 mikrometrów.

Pracując przy mikroskopie stereoskopowym, umieść w sterylnym kapturze hodowlanym, włóż igłę do uchwytu do wstrzykiwań i przymocuj ją do mikromanipulatora. Pobrać około 10 mikrolitrów roztworu bakteryjnego do igły. Następnie umieść 4-dołkową płytkę do hodowli komórkowej zawierającą organoidy żołądkowe pod mikroskopem stereoskopowym.

Poruszając się za pomocą mikromanipulatora, umieść igłę blisko organoidu. Włóż igłę do organoidu jednym szybkim ruchem, a następnie wstrzyknij około 0,2 mikrolitra roztworu bakteryjnego do środka organoidu. Dzięki doświadczeniu około 30 największych organoidów w studni można wstrzyknąć w ciągu 5 minut. Inkubować wstrzyknięte organoidy przez żądany czas w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Często osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, mają trudności, ponieważ trudno jest im skutecznie celować w organoidy. Organoidy żołądka myszy rosną torbielowate i są najłatwiejsze do namierzenia. Tak więc wstrzyknięcie mysich organoidów żołądkowych z np. barwnikiem może być dobrą praktyką dla tej techniki.