JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 5:13 min. • July 8th, 2025
Weź wielodołkową płytkę zawierającą przylegające komórki nabłonkowe i potraktuj ją mutantami Coxiella znakowanymi zielonym fluorescencyjnym białkiem; niektóre z mutacjami w genie systemu wydzielania typu IV lub genie T4SS - kluczowym dla replikacji.
Mutanty replikacyjne oddziałują z komórkami nabłonkowymi, wywołując pochłanianie Coxiella, tworząc wakuolę zawierającą Coxiellę lub CCV i rekrutując glikoproteinę błonową-1 związaną z lizosomami lub LAMP1 do CCV.
Ułatwia to wydzielanie białek efektorowych do cytoplazmy komórki za pośrednictwem systemu wydzielania typu IV, promując replikację bakterii.
Mutanty z mutacjami genu T4SS pozostają niereplikowane.
Po inkubacji wybarwić komórki barwnikiem fluorescencyjnym, utrwalić je i przeniknąć przez błonę komórkową.
Wprowadzić przeciwciała pierwszorzędowe specyficzne dla LAMP1 oddziałujące z białkami LAMP1 na CCV.
Nakładka z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi czerwonym fluoroforem, oddziałującymi z przeciwciałami pierwszorzędowymi, podczas gdy barwnik Hoechst barwi jądra komórek.
Pod mikroskopem epifluorescencyjnym wakuole czerwonej fluorescencji zawierające mniej zielonej Coxiella w pobliżu jądra wskazują na wadliwą replikację mutant
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych