Pomiar egzocytozy komórek tucznych poprzez uwalnianie monomerycznego białka czerwonej fluorescencji Neuropeptydu Y
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:14 min. • July 8th, 2025
Weźmy transfekowane komórki tuczne eksprymujące NPY-mRFP, białko fuzyjne zawierające neuropeptyd Y i monomeryczne białko czerwonej fluorescencji, w ich cytoplazmatycznych ziarnistościach wydzielniczych.
Wyjmij nośnik. Odpipetować bufor zawierający wapń odczynnikiem aktywującym, jonoforem wapnia i rozpocząć inkubację.
Jonofory te indukują napływ wapnia, zwiększając wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia i mobilizując granulki wydzielnicze do błony komórkowej.
Wapń wiąże się z białkami wiążącymi wapń na błonie ziarnistości wydzielniczej.
Ponadto granulki wydzielnicze łączą się z błoną plazmatyczną, w której pośredniczą białka związane z błoną, co powoduje egzocytozę i uwalnianie zawartości, w tym NPY-mRFP.
Po inkubacji zebrać i przenieść uwolniony supernatant zawierający NPY-mRFP na czarną płytkę wielodołkową.
Dodaj niejonowy detergent, aby zlizować komórki i uwolnić pozostały wewnątrzkomórkowy NPY-mRFP.
Zebrać i przenieść lizat komórkowy na płytkę wielodołkową.
Za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych zmierz fluorescencję supernatantu i lizatu komórek, aby określić ilościowo procent uwolnionego NPY-mRFP i określić zakres egzocytozy komórek tucznych.
Aby zmierzyć egzocytozę NPY-mRFP, u
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych