JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 4:07 min. • July 8th, 2025
Weźmy kompleksy transfekcyjne zawierające reporterowe mRNA kodujące lucyferazę świetlika lub Fluc i lucyferazy Renilla lub Rluc.
mRNA Fluc zawiera sekwencję 5' poliadenozyny lub lidera poli(A), podczas gdy mRNA Rluc nie ma tej sekwencji.
Transfekcja niezakażonych i zakażonych wirusem ospy komórek ssaków w celu dostarczenia reporterowych mRNA i inkubacji.
W niezakażonych komórkach eukariotyczne czynniki inicjacji wiążą się z czapeczką 5' mRNA, a następnie rekrutacja małej podjednostki rybosomalnej i inicjującego tRNA.
Po tym, jak mała podjednostka lokalizuje kodon start, duża podjednostka łączy się, aby zsyntetyzować białka lucyferazy.
W zakażonych komórkach fosforylacja małej podjednostki za pośrednictwem pokswirusa powoduje składanie rybosomów bezpośrednio w sekwencji wiodącej, zwiększając produkcję fluc.
Lizuj komórki, aby uwolnić lucyferazy.
Dodaj substrat Fluc, który enzym utlenia, emitując światło. Za pomocą czytnika płytek zmierz luminescencję.
Powtórz ten krok dla Rluc, aby określić względny wzrost luminescencji Fluc w porównaniu do Rluc w komórkach zakażonych wirusem.
Wysiewaj komórki HeLa na 24-dołkowej płytce, aby osiągnąć zlewność od 80% do 90% następnego dnia i inkubuj
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych