Wytwarzanie rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych z kultur komórkowych ssaków

Przygotować mieszankę transfekcyjną, dodając odpowiedni polimer kationowy i oddzielne wektory plazmidowe dla genów przeciwciał o łańcuchach ciężkich i lekkich.

Dodatnio naładowany polimer wiąże się z ujemnie naładowanymi plazmidami, tworząc kompleksy.

Dodać tę mieszaninę transfekcji do wielodołkowej płytki zawierającej hodowlę ludzkich embrionalnych komórek nerki w podłożu bez surowicy i inkubować.

Kompleksy dostają się do komórek przez endocytozę, powodując obrzęk i pęknięcie endosomalne, uwalniając je do cytoplazmy.

Polimer kationowy wytwarza pory w błonie jądrowej, ułatwiając wnikanie wektorów i umożliwiając ich transkrypcję, a następnie translację na białka o łańcuchach ciężkich i lekkich.

Białka te przemieszczają się do retikulum endoplazmatycznego, gdzie białka o łańcuchach ciężkich i lekkich są dimeryzowane i kowalencyjnie połączone wiązaniami dwusiarczkowymi, tworząc przeciwciała.

Przeciwciała przemieszczają się do aparatu Golgiego w celu dodatkowych modyfikacji potranslacyjnych i są pakowane w pęcherzyki w celu uwolnienia zewnątrzkomórkowego.

Zebrać pożywkę zawierającą uwolnione przeciwciała. Dodaj pożywkę bez surowicy, aby kontynuować wytwarzanie przeciwciał.

Przygotuj komórki HEK w uzupełnionym DMEM i wyhoduj je do 75% konfluencji w kolbach hodowlanych o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Dla każdej transfekcji łańcucha ciężkiego/lekkiego przygotuj mieszankę z 1,75 mililitra DMEM bez surowicy. Uwzględnij 4,5 mikrograma wektora o ciężkim łańcuchu, 3 mikrogramy wektora o lekkim łańcuchu i 50 mikrolitrów roztworu polietyleneniminy. Delikatnie dodaj tę mieszaninę do płytki z komórkami HEK i zamieszaj roztwór na płytce.

Inkubuj płytkę przez noc, a następnie zacznij codziennie zbierać pożywkę hodowlaną, zastępując ją pożywką bez surowicy. Pożywka zawiera przeciwciała i może być pobierana codziennie przez cztery dni.