Kontrolowany wlew przeciwciał swoistych dla peptydu Aβ i oligomerów Aβ do hipokampa szczura

Weźmy obudzonego szczura z dwiema kaniulami prowadzącymi wszczepionymi obustronnie do hipokampa.

Kaniule są połączone z podskórnie wszczepionymi pompami osmotycznymi zawierającymi odpowiednio przeciwciała swoiste dla amyloidu beta lub Aβ i kontrolne.

Wysokie stężenie przeciwciał w pompie indukuje dyfuzję wody z otaczającej tkanki przez jej zewnętrzną półprzepuszczalną błonę, rozszerzając warstwę osmotyczną.

Ta ekspansja ściska zbiornik przeciwciał, ułatwiając kontrolowane uwalnianie przeciwciał.

Podłącz dwie kaniule wewnętrzne do cewników wypełnionych sterylną wodą podłączonych do pompy infuzyjnej.

Napełnij kaniule wodą.

Następnie zasysaj niewielką ilość powietrza, tworząc pęcherzyk.

Teraz wypełnij kaniule neurotoksycznymi oligomerami Aβ, rozpuszczalnymi agregatami peptydów Aβ.

Włóż kaniule wewnętrzne do kaniul prowadzących. Uruchomić pompę w celu kontrolowanego dostarczania oligomerów, wykorzystując pęcherzyki powietrza, aby zapobiec przepływowi wstecznemu i śledzić szybkość infuzji.

Podawać wielokrotne wstrzyknięcia oligomerów przez wymagany czas.

Model jest gotowy do badania oddziaływań oligomer-przeciwciało Aβ.

Na dzień przed montażem napełnić pompy osmotyczne przeciwciałem 6E10 lub przeciwciałem kontrolnym IgG1 zgodnie z instrukcjami producenta. Umieść pompy w sterylnej wodzie destylowanej i utrzymuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby aktywować pompy.

Gdy szczur zostanie znieczulony 3% izofluranem i ogolony między łopatkami, zdezynfekuj skórę roztworem 2% glukonianu chlorheksydyny i 2% alkoholu izopropylowego. Po wykonaniu nacięcia o długości 2 centymetrów skalpelem między łopatkami, zlokalizuj cewniki PE-50 połączone z kaniulą prowadzącą.

Następnie odetnij skalpelem końce cewników PE-50 zawierających cement dentystyczny. Podłącz pompy osmotyczne do cewników PE-50 i dodaj trochę cementu dentystycznego na złączu pompy i cewnika, aby zabezpieczyć połączenie. Na koniec szczelnie zszyj skórę szwami 4/0. Umieść zwierzę z powrotem w klatce na ciepłej poduszce grzewczej i monitoruj je, gdy budzi się ze znieczulenia izofluranem.

Po przygotowaniu roztworu oligomeru beta-amyloidu, jak podawano wcześniej, przed infuzją należy pozostawić roztwór do dynamicznej i spontanicznej agregacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie napełnij każdą strzykawkę 5 mikrolitrami sterylnej wody destylowanej.

Następnie przytnij skalpelem dwa cewniki PE-50 do długości około 60 centymetrów. Użyj dwóch 1-mililitrowych strzykawek wyposażonych w igły o rozmiarze 21, aby napełnić oba cewniki sterylną wodą destylowaną. Podczas gdy strzykawki o pojemności 1 mililitra pozostają na miejscu, na jednym końcu każdego cewnika połącz wolne końce ze strzykawkami Hamiltona. Wyjmij strzykawki o pojemności 1 mililitra i sprawdź, czy w cewnikach nie ma pęcherzyków powietrza.

Wprowadzić kaniulę wewnętrzną na końcu cewników PE-50. Użyj strzykawek Hamiltona, aby napełnić każdą wewnętrzną kaniulę do 1 mikrolitra, a następnie utwórz pęcherzyk powietrza, pociągając tłok do tyłu do oznaczenia 2 mikrolitrów.

Teraz wymieszaj roztwór oligomeru beta-amyloidu, pipetując w górę i w dół, używając końcówki o minimalnej przyczepności. Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas mieszania. Następnie napełnij obie wewnętrzne kaniule 1,5 mikrolitra roztworu oligomeru beta-amyloidu, pociągając tłoki z powrotem do 3,5 mikrolitra.

Następnie zaznacz linie przed i za pęcherzykiem powietrza w obu cewnikach. Służy to jako punkt kontrolny trwającej infuzji. Umieść obudzonego szczura w przytulnym uścisku i unieruchamij jego głowę. Wyjmij atrapę kaniuli z kaniuli dwuprowadnicowej, a następnie włóż wcześniej przygotowaną kaniulę wewnętrzną do kaniuli prowadzącej. Sprawdź, czy są całkowicie włożone i dobrze przymocowane do podstawy kaniuli prowadzącej. Teraz uwolnij szczura z przytulnego uchwytu i umieść go z powrotem w klatce, aby ograniczyć stres związany z obchodzeniem się z nim.

Włączyć pompę infuzyjną i wstrzyknąć 1 mikrolitr roztworu oligomeru beta-amyloidu z szybkością 0,1 mikrolitra na minutę. Podczas infuzji należy sprawdzić, czy tłok strzykawki porusza się z 3,5 mikrolitra do 2,5 mikrolitra i czy pęcherzyki powietrza w obu cewnikach PE-50 poruszają się w sposób ciągły. Sprawdź szczura, aby upewnić się, że cewniki nie skręcają się ze sobą.

Pozostaw wewnętrzną kaniulę na miejscu przez kolejne 5 minut po infuzji, aby umożliwić skuteczną dyfuzję roztworu oligomeru beta-amyloidu. Po infuzji należy umieścić szczura z powrotem w ciasnym uchwycie i wyjąć kaniulę wewnętrzną oraz kaniulę z nasadką, aby zapobiec refluksowi wstrzykniętego roztworu. Umieść atrapę kaniuli, która zatrzymała się tuż przed ramieniem kątowym kaniuli prowadzącej. Na koniec włóż zwierzę z powrotem do klatki.