Wytwarzanie wielowalentnej szczepionki pęcherzykowej z błoną zewnętrzną

Weźmy polipleksy transfekcyjne zawierające docelowe plazmidy związane z polimerem. Plazmidy kodują antygen wirusowy połączony ze znacznikiem peptydowym i znacznikiem powinowactwa.

Inkubuj polipleksy z komórkami ssaków, które internalizują polipleksy wewnątrz endosomów.

Polimer indukuje pękanie pęcherzyków. Uwolnione plazmidy wyrażają antygen wirusowy, który jest wydzielany zewnątrzkomórkowo.

Zebrać supernatant zawierający antygen i zanieczyszczenia. Dodaj konkurencyjny środek w niskim stężeniu.

Załaduj go do kolumny chromatografii powinowactwa.

Znaczniki powinowactwa wiążą się z żywicą kolumnową, unieruchamiając antygen, podczas gdy konkurencyjny czynnik zmniejsza niespecyficzne wiązanie.

Przelej konkurencyjny środek w niskim stężeniu, usuwając słabo związane zanieczyszczenia.

Przemyć zwiększającymi się stężeniami konkurencyjnego czynnika, aby przemieścić silnie związane antygeny, uwalniając je.

Wprowadzić bakteryjne pęcherzyki błony zewnętrznej lub OMV z białkiem wychwytującym związaną z powierzchnią i inkubować.

Znaczniki peptydów antygenowych wiążą się z białkami wychwytującymi, tworząc szczepionkę OMV z wielowalentnym wyświetlaczem antygenu

Wykonaj oczyszczanie OMV SpyCatcher. Zacznij od odwirowania roztworu bakteryjnego. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra membranowego o średnicy 0,22 mikrometra, a następnie zagęścić go za pomocą kolumny z pustych włókien. Przefiltrować koncentrat przez filtr membranowy o średnicy 0,22 mikrometra, a następnie odwirować go w temperaturze 150 000 razy g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwie godziny za pomocą ultrawirówki i wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Ponownie zawiesić opady za pomocą PBS i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby przeprowadzić transfekcję RBD-SpyTag, zacznij od wyboru odpowiedniego systemu ekspresji eukariotycznej, a po wyzdrowieniu hoduj komórki przez noc z prędkością 130 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 20 mikrolitrów HEK293F roztworu komórkowego do automatycznego licznika komórek. Zapisz liczbę komórek. Dostosuj stężenie do 1 razy 10 do szóstych komórek na mililitr, a następnie hoduj komórki z prędkością 130 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 4 godziny.

Przefiltruj plazmid RBD-SpyTag przez filtr membranowy o średnicy 0,22 mikrometra i dodaj 300 mikrogramów plazmidów do pożywki do hodowli komórkowej, aż ostateczna objętość wyniesie 10 mililitrów. Wstrząsaj przez 10 sekund. Podgrzej PEI do 65 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Wymieszaj 0,7 mililitra PEI z 9,3 mililitra pożywki do hodowli komórkowych i wstrząsaj z przerwami przez 10 sekund.

Dodaj roztwór plazmidu do roztworu PEI. Potrząsaj mieszaniną z przerwami przez 10 sekund i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Dodaj mieszaninę do 280 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych i hoduj z prędkością 130 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 dni.

Następnie wykonaj oczyszczanie RBD-SpyTag. Zacznij od odwirowania komórek w temperaturze 6000 razy g w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 minut. i użyć pipety, aby zebrać supernatant. Zbuduj kolumnę z 2 mililitrami agarozy niklowo-NTA i umyj ją trzykrotnie PBS.

Dodaj imidazol do supernatantu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie 20 milimolów i załaduj supernatant komórki. Dodać 3 objętości kolumny PBS zawierającej 20 milimoli imidazolu do przemywania i zebrać frakcję płuczącą. Elucja gradientowa z trzema objętościami kolumnowymi PBS zawierającymi niskie do wysokich stężeń imidazolu. Eluować dwukrotnie dla każdego stężenia.

Aby określić stężenie białka metodą BCA, należy seryjnie rozcieńczyć wzorcowy roztwór białka BSA od 2 do 0,0625 miligrama na mililitr. Rozcieńczyć oczyszczony OMV SpyCatcher i RBD-SpyTag 10 razy. Następnie wymieszaj roztwory robocze BCA A i B w stosunku 50 do 1. Dodaj rozcieńczony roztwór białka i wymieszaj z roztworem roboczym BCA. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Zmierz absorbancję w 562 nanometrach każdego dołka i oblicz stężenie białka na podstawie krzywej wzorcowej.

Aby przeprowadzić biokoniugację OMV SpyCatcher i RBD-SpyTag, wymieszaj OMV SpyCatcher z RBD-SpyTag w PBS w stosunku 40 do 1. Obróć w pionie, aby zmiksować mieszaninę przez noc z prędkością 15 obrotów na minutę w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przeprowadzić oczyszczanie OMV RBD za pomocą roztworu PBS, stosując procedurę podobną do oczyszczania OMV SpyCatcher.