JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:43 min. • July 8th, 2025
Zacznij od zamrożonego roztworu polimeru zawierającego dodatnio naładowane polimery.
Rozmrozić roztwór polimeru, aż osiągnie temperaturę pokojową.
Dodaj bufor i wir, aby uzyskać równomierne mieszanie, generując jednorodny roztwór.
Wprowadź docelowe mRNA do roztworu polimeru w równym stosunku, aby uzyskać optymalną reakcję.
Inkubuj, aby umożliwić dodatnio naładowanym polimerom interakcję z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi w mRNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne.
Ułatwia to wbudowywanie mRNA w strukturę polimeru, tworząc nanocząstki kompleksów mRNA-polimer lub polipleksów.
Przenieś te polipleksy do probówki zawierającej wodę wolną od RNaz.
Wymieszaj je i pozwól na wytrącenie się polipleksów.
Wprowadzić bufor zawierający sacharozę i zamrozić go. Sacharoza działa jako krioprotektant, który utrzymuje integralność strukturalną polipleksów.
Następnie wykonaj liofilizację, aby usunąć wszelkie ślady wody.
Przechowuj go w niskiej temperaturze jako kandydata na szczepionkę mRNA do wykorzystania w przyszłości.
W celu wytworzenia polipleksów należy rozmrozić wcześniej przygotowane polimery peptyd C-6 poli-beta aminoestry i odwirować roztwór. Po odpipetowaniu mieszaniny polimerowej w górę i w dół, przygotować 12,5-milimolowy roztwór w octanie sodu. Zwiruj roztwór i odczekaj 10 minut.
Następnie przygotuj mRNA w ilości 0,5 miligrama na mililitr i wymieszaj przez pipetowanie. Ponownie zwirować roztwór polimeru. Następnie wymieszaj roztwór materiału genetycznego w roztworze polimeru w stosunku jeden do jednego w probówce do mikrowirówki i inkubuj probówkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 30 minut w bloku termicznym. Po inkubacji wytrącić mieszaninę jedną lub dwiema wodami wolnymi od RNaz, dodając próbkę do probówki mikrowirówki zawierającej wodę.
Następnie, aby uwzględnić substancje pomocnicze, dodać 20-milimolowy HEPES i 4-procentowy roztwór sacharozy w tej samej objętości, co mieszanina mRNA i poli-beta estrów aminowych i wymieszać przez pipetowanie. W przypadku liofilizacji, po zamrożeniu roztworu polipleksu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę, należy przeprowadzić suszenie wstępne, a następnie natychmiast przechowywać polipleksy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby uniknąć ponownego nawodnienia.