Izolacja mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy

Weźmy świeżo pobraną korę mózgową myszy.

Pokrój tkankę na małe fragmenty. Przenieść je do schłodzonego homogenizatora zawierającego bufor z inhibitorami RNaz i DNazami.

Homogenizuj tkankę optymalnie, aby uwolnić komórki do zawiesiny, selektywnie zachowując mikroglej ze względu na ich zdolność do wytrzymywania sił ścinających i utrzymywania żywotności błony, jednocześnie eliminując neurony i inne komórki glejowe.

Co więcej, inhibitory RNaz degradują RNazy, podczas gdy DNazy degradują wszelkie zanieczyszczające DNA.

Przepuść zawiesinę komórek przez sitko do komórek, aby usunąć resztki tkanek.

Przenieść zawiesinę komórek do probówki. Odwirować i usunąć sklarowany nad osadem zawierający enzymy. Ponownie zawieś komórki w buforze.

Dodaj mikrokulki magnetyczne anty-mielinowe. Te mikrogranulki celują w białko mieliny, wiążąc resztki mieliny i oligodendrocyty.

Załaduj mieszaninę komórek i kulek do kolumny zubożającej składającej się z matrycy z kulkami ferromagnetycznymi.

Pod wpływem przyłożonego pola magnetycznego resztki mieliny i oligodendrocyty związane z mikrokulkami są zatrzymywane w kolumnie, podczas gdy komórki mikrogleju przechodzą przez nią.

Przemyć kolumnę buforem i zebrać przepływowy roztwór zawierający mikroglej.

Najpierw użyj żyletki, aby posiekać każdy obszar mózgu na drobne kawałki o wielkości mniejszej niż 1 milimetr sześcienny. Za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra z odciętą końcówką przenieś kawałki tkanki do wstępnie schłodzonych homogenizatorów Dounce. Homogenizuj tkankę, powoli wkręcając i wysuwając tłok z homogenizatora Dounce przez 6 do 10 pełnych ruchów, aż nie będzie żadnych widocznych kawałków. Następnie przenieś zdysocjowane tkanki do 50-mililitrowych probówek przez sitka o średnicy 70 mikrometrów.

Przepłucz każdy homogenizator i tłok Dounce łącznie 6 mililitrami zimnego podłoża A, a następnie przenieś płukanie do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania. Odwirować zawiesinę jednokomórkową o temperaturze 400 razy g i w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut z przerwą o godzinie 5.

Przepłukać jedną dużą kolumnę zubożającą i trzy duże kolumny selekcyjne w separatorze magnetycznym za pomocą 3 mililitrów MCS. Po zakończeniu wirowania próbek tkanek odpipetować i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić komórki w buforze MCS, który zawiera inhibitor RNazy.

Dodaj 100 mikrolitrów kulek do usuwania mieliny do każdej probówki zawierającej zawieszone komórki z kory i móżdżku i dodaj 50 mikrolitrów kulek do usuwania mieliny do każdej z probówek zawierających zawieszone komórki z hipokampa i prążkowia. Inkubuj probówki na lodzie przez 10 minut.

Następnie dodaj MCS do probówki zawierającej komórki korowe, aby zwiększyć jej objętość do 2 mililitrów, a do pozostałych probówek, aby każda z ich objętości osiągnęła 1 mililitr. Gdy kolumny są opróżnione z buforu płuczącego, załaduj 2 mililitry komórek korowych na dużą kolumnę zubożającą i 1 mililitr zawiesiny każdej innej komórki na oddzielne duże kolumny selekcyjne. Następnie przemyj dużą kolumnę zubożającą raz 1 mililitrem buforu MCS i umyj każdą dużą kolumnę selekcyjną dwa razy, używając 1 mililitra buforu MCS do każdego przemycia.