Wytwarzanie dojrzałych organoidów móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu bioreaktorów jednorazowego użytku

Wysiewanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w bioreaktorze. Komórki iPS są ponownie zawieszane w pożywkach zawierających inhibitor apoptozy komórkowej.

Pod wpływem pola magnetycznego pionowe koło bioreaktora obraca się z kontrolowaną prędkością, ułatwiając kontakt komórka-komórka i tworzenie agregatów. Usuń większość pożywki i dodaj nową pożywkę bez inhibitora.

Kontynuuj hodowlę. Gdy agregaty osiągną optymalną wielkość, pozwól im osiąść grawitacyjnie. Usuń nośnik.

Dodać pożywkę różnicującą zawierającą czynniki wzrostu i kulturę o zmniejszonej prędkości koła bioreaktora. Czynniki wzrostu sprzyjają różnicowaniu neuronalnemu w obrębie agregatów.

Następnie dodaj świeżą pożywkę uzupełnioną czynnikami wzrostu i chemokinami, które indukują rozwój przodków móżdżku.

Stopniowo przodkowie móżdżku organizują się w odrębne warstwy w agregatach, tworząc wczesne organoidy móżdżku.

Na koniec dodaj pożywkę neuronalną zawierającą określone czynniki neurotroficzne.

Czynniki te indukują dojrzewanie progenitorów móżdżku do synaptycznie aktywnych funkcjonalnych neuronów móżdżku, generując dojrzałe organoidy.

W dniu 1, przy czym dzień 0 jest dniem wysiewu bioreaktora, należy umieścić bioreaktor i jednostkę bazową w sterylnym okapie przepływowym. Następnie za pomocą pipety serologicznej pobrać 1-mililitrową próbkę zawiesiny komórek. Umieść zawiesinę komórek w 24-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu. Użyj mikroskopu, aby potwierdzić, że uformowały się agregaty pochodzące z iPSC. Jeśli tak, uchwyć obrazy agregatów z powiększeniem 40x lub 100x.

Kontynuować hodowlę iPSC w bioreaktorze, aż średnia średnica agregatów wyniesie 100 mikrometrów. Następnie zastąp 80% pożywki świeżym mTesR1 bez inhibitora ROCK. Gdy agregaty osiągną średnicę od 200 do 250 mikrometrów, pozwól wszystkim organoidom osiąść na dnie bioreaktora. Następnie zastąp wszystkie zużyte nośniki pożywką różnicującą gfCDM.

Umieść jednostkę bazową i bioreaktor w inkubatorze i zmniejsz mieszanie do 25 obr./min.