Izolacja neuronów DRG i kokultura z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia komórek Schwanna

Weźmy rdzeń kręgowy zarodka szczura z przyczepionymi zwojami korzenia grzbietowego lub DRG, zawierającymi neurony i komórki glejowe.

Odłącz poszczególne DRG od pępowiny, przenieś je do probówki i odwiruj, odrzucając wszelkie resztki tkanek.

Dodaj enzymy, aby zdysocjować neurony DRG i komórki glejowe.

Zakręć ogniwami i usuń wszelkie zanieczyszczenia. Dodaj neuronalną pożywkę podtrzymującą i rozcieraj, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową.

Przenieś zawiesinę do mikropłytki pokrytej substratem hodowlanym, promując przyleganie komórek.

Wprowadzić pożywkę oczyszczającą i inkubować. Czynniki hamujące pożywki eliminują dzielące się komórki glejowe, podczas gdy niedzielące się neurony przeżywają.

Weźmy komórki podobne do komórek Schwanna lub SCLC w pożywce do wspólnej hodowli. SCLC, prekursor komórek Schwanna, oddziałuje z embrionalnymi neuronami nerwów obwodowych.

Wprowadzić zawiesinę do neuronów DRG i inkubować. Interakcja SCLC z neuronami DRG sprzyja ich dojrzewaniu do komórek Schwanna.

Wygenerowane komórki Schwanna są gotowe do analizy.

Aby pobrać zwoje korzenia grzbietowego, przenieś pierwszy zarodek do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego zawierającego PBS o temperaturze pokojowej pod mikroskopem preparacyjnym w pozycji leżącej i włóż kleszcze do mikropreparowania po obu stronach rdzenia kręgowego.

Za pomocą sekcji oddziel rdzeń kręgowy od otaczającej go tkanki miękkiej, używając kleszczy do wycięcia rdzenia kręgowego wzdłuż otworu szyi i kikuta ogona. Usuń resztki tkanki miękkiej z uwolnionego rdzenia kręgowego, aż pozostanie tylko rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe i przyczepiony ganglion korzenia grzbietowego.

Odłącz poszczególne zwoje korzenia grzbietowego od łączących je korzeni nerwowych. Następnie użyj pisaka wyposażonego w 1-mililitrową końcówkę do pipety, aby przenieść do 100 grzbietowych zwojów korzeniowych do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej PBS.

Zebrać zwoje przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach rekombinowanego odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych na probówkę. Po 10 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza ponownie odwiruj zwoje korzenia grzbietowego za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby delikatnie rozcierać granulki w pożywce podtrzymującej neuron zazwojowy korzenia grzbietowego.

Wysiewaj komórki zwojowe korzenia grzbietowego w odległości 5 x 10³ komórek na centymetr kwadratowy na sześciodołkowych płytkach pokrytych lamininą poli-D-lizyną w 1,5 mililitra pożywki podtrzymującej neuron zwoju korzenia grzbietowego na dołek.

Po dwóch dniach w hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO₂ umyj komórki i włóż hodowle komórek neuronalnych do inkubatora w świeżej pożywce do oczyszczania neuronów zwoju korzenia grzbietowego przez kolejne dwa dni.

Po 3 do 4 cyklach konserwacji i oczyszczania, hodowle komórek zwojowych korzenia grzbietowego powinny być dodatnie dla markera neuronalnego Tuj-1 i ujemne dla markera komórek glejowych S100 beta.

W 7 dniu hodowli komórek podobnych do komórek Schwanna przepłukać komórki w PBS, a następnie przeprowadzić dysocjację za pomocą 0,5 mililitra rekombinowanego enzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek na studzienkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do kohodowli i wysiać komórki podobne do komórek Schwanna na oczyszczonej hodowli neuronów zwojowych korzenia grzbietowego w ilości 1 x 10³ komórek na centymetr kwadratowy przez 14 dni kohodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO₂ .