Generowanie kultury organoidów z zawiesiny komórek guza mózgu

Zacznij od probówki mikrowirówkowej zawierającej bogatą w lamininę macierz zewnątrzkomórkową lub lrECM. Laminina jest składnikiem strukturalnym występującym obficie w mózgu.

Trzymaj probówkę na lodzie, aby zapobiec polimeryzacji IrECM.

Dodaj komórki guza mózgu i dokładnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek.

Następnie przenieś mieszaninę na formy parafilmowe, tworząc kropelki.

Inkubuj w celu ułatwienia polimeryzacji lrECM w celu utworzenia rusztowania, naśladując naturalne środowisko komórek.

Teraz przepłucz zestalone organoidy na szalkę Petriego zawierającą pożywkę hodowlaną, a następnie inkubuj.

Pożywka hodowlana dostarcza niezbędnych składników odżywczych i czynników wzrostu, wspomagając podział komórek.

W organoidzie komórki samoorganizują się poprzez migrację i inwazję.

Po inkubacji przechylić płytkę, aby osadzić organoidy.

Ostrożnie usuń nadmiar podłoża i dodaj świeże podłoże.

Inkubować z delikatnym potrząsaniem.

To równomiernie rozprowadza składniki odżywcze i zwiększa wzrost organoidów.

Aby wytworzyć organoidy z zawiesiny jednokomórkowej, dodaj odpowiednią ilość bogatej w lamininę macierzy zewnątrzkomórkowej lub lrECM do małej probówki wirówkowej w wiadrze z lodem lub zimnym bloku.

Przygotuj mieszaninę komórek zawierającą 20 000 komórek na organoid. Mieszaninę zawiesiny komórkowej lrECM należy dokładnie wymieszać, aby uniknąć osiadania komórek, co mogłoby spowodować niejednorodne tworzenie organoidów. Następnie ostrożnie odpipetuj 20 mikrolitrów mieszaniny na formę parafilmową, aby utworzyć perłową kroplę. Upewnij się, że końcówka pipety jest chłodzona co dwa do trzech organoidów, aby zapobiec polimeryzacji lrECM.

Po odpipetowaniu żądanej liczby organoidów na formę parafilmu na 10-centymetrowej płytce hodowlanej, należy inkubować organoidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 do 2 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po zestaleniu organoidów delikatnie spłucz organoidy z formy parafilmowej pożywką NBMC za pomocą końcówki P1000 i zbierz je na nową 10-centymetrową płytkę hodowlaną zawierającą 20 mililitrów NBMC. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze bez wstrząsania przez 4 dni.

Po 4 dniach wymień nośnik w płycie. Aby to zrobić, umieść kawałek ciemnego papieru pod płytką do hodowli komórkowej. Przechyl talerz i odczekaj 20 sekund. Gdy organoidy całkowicie osiądą na dnie naczynia, powoli wyjmij pożywkę za pomocą szklanej pipety z dużym otworem.

Po dodaniu nowych pożywek umieść płytkę w inkubatorze na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 80 obr./min, a następnie wymieniaj pożywkę co 2 do 3 dni.