Wspólna hodowla komórek Schwanna z neuronami DRG na wstępnie rozciągniętej błonie

Weź komorę krzemową przymocowaną do pokrytej matrycą, rozciągniętej membrany krzemowej.

Dodaj zwoje korzenia grzbietowego lub zawiesinę komórek DRG i inkubuj.

Macierz wspomaga przyłączanie i namnażanie komórek, podczas gdy rozciągnięta powierzchnia kieruje wyrównaniem aksonów.

Dodaj inhibitory wzrostu, które eliminują aktywnie dzielące się komórki glejowe, umożliwiając przetrwanie neuronom niedzielącym się.

Usuń nośnik. Dodaj pożywkę wzrostową i inkubuj.

Neuron wyczuwa zwiększoną sztywność błony w kierunku rozciągnięcia i odpowiednio orientuje wzrost aksonów.

Dodać wyhodowane i zebrane komórki Schwanna do kultury DRG i inkubować.

Komórki Schwanna przyczepiają się do zregenerowanego aksonu, izolując neuron.

Zwiększa to przeżywalność i funkcjonalność neuronów, ustanawiając wspólną kulturę.

Przed wysiewem neuronów DRG usuń roztwór PLL z komory. Spłucz powierzchnię PDMS sterylną wodą i wysusz ją na powietrzu. Po ponownym wywieszeniu ogniw pozostaw zawiesinę na 1 do 2 minut, aby zanieczyszczenia osiadły na dnie rurki. Następnie dodaj 1,5 mililitra zawiesiny komórkowej do każdej komory rozciągania i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO₂ .

Aby wyeliminować komórki glejowe w ciągu jednego dnia in vitro, dodaj 10 mikrolitrów lub 15 mikrolitrów roztworu podstawowego mieszaniny FdU/U do każdej studzienki. Po 7 godzinach zastąp tę pożywkę świeżą standardową pożywką wzrostową i umieść wstępnie rozciągnięte urządzenie do hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO₂ . W okresie hodowli komórkowej zmieniaj pożywkę co dwa dni, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą pożywką.

W tej procedurze należy usunąć pożywkę hodowlaną z komórek Schwanna i dodać 5 mililitrów 0,05% trypsyny-EDTA do kolby. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO₂ przez 2 do 3 minut. Sprawdź komórki pod mikroskopem optycznym za pomocą obiektywu 10x, aby zobaczyć, czy unoszą się z kolby. Następnie dodać 5 mililitrów pożywki hodowlanej do komórek w kolbie i wymieszać.

Następnie dodaj zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 5 minut. Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad w 7 mililitrach standardowej pożywki wzrostowej DOG. Następnie przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do 0,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Wymieszaj go z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego, a następnie policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru, używając obiektywu 10x.

Dodaj pożywkę wzrostową, aby rozcieńczyć zawiesinę komórek do 5,000 komórek na mililitr. Następnie należy usunąć 0,5 mililitra pożywki z kultury DRG w rozciągniętej komorze i dodać 0,5 mililitra zawiesiny komórek Schwanna do hodowli DRG. Hoduj komórki przez tydzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO₂ . Zmieniaj pożywkę co dwa dni, zastępując połowę zużytego podłoża świeżą standardową pożywką.