Ustanowienie pierwotnej hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego z kręgosłupa szczura

Weźmy kręgosłup szczura. Wykonaj dwa nacięcia wzdłuż jego boków i jedno cięcie boczne.

Usuń mięśnie grzbietowe i grzbietową część kręgów.

Wyciągnij rdzeń kręgowy.

Zidentyfikuj zwoje korzenia grzbietowego lub DRG, znajdujące się obustronnie wzdłuż kręgów lędźwiowych.

DRG zawierają neurony otoczone komórkami glejowymi.

Wytnij DRG i zbierz je do naczynia. Kilkakrotnie przemyj chusteczkę pożywką bez surowicy.

Przenieść DRG na płytkę zawierającą roztwór kolagenazy i inkubować. Kolagenaza degraduje macierz zewnątrzkomórkową.

Umyć buforem. Dodaj trypsynę-EDTA i inkubuj, aby przerwać połączenia komórka-komórka, rozluźniając komórki.

Przenieść DRG do probówki, odwirować i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić tkankę w pożywce hodowlanej i kilkakrotnie pipetować, aby uwolnić komórki.

Przenieś komórki na płytkę hodowlaną pokrytą polimerem, aby ułatwić przyczepienie.

Usuń pożywkę i dodaj nową pożywkę zawierającą inhibitory i czynniki wzrostu.

Inhibitory ograniczają proliferację komórek glejowych, podczas gdy czynniki wzrostu sprzyjają wzrostowi neuronów.

Zbierz zwoje korzenia grzbietowego lędźwiowego z pnia dwu- lub trzytygodniowego szczura. Zacznij od wykonania dwóch cięć wzdłuż boków kręgosłupa i jednego cięcia bocznego, aby zaznaczyć rostralny zasięg kręgosłupa lędźwiowego. Następnie użyj kleszczy do cięcia kości, aby usunąć mięśnie grzbietowe kręgosłupa. Następnie usuń grzbietową część kręgów i odsłoń rdzeń kręgowy, a następnie użyj nożyczek preparacyjnych i kleszczy, aby usunąć rdzeń kręgowy.

Zidentyfikuj DRG odcinka lędźwiowego, licząc kręgi od ostatniego żebra. Ten diagram pokazuje pozycje kręgów. Użyj mikronożyczek, aby zebrać 12 obustronnych DRG odcinka lędźwiowego od L1 do L6. Usuń wszelkie przyczepione włókna neuronalne, aby poprawić czystość kultury. Przenieś każdy DRG lędźwiowy do 35-milimetrowej naczynia hodowlanej zawierającej 2 mililitry lodowatej pożywki bez surowicy.

Przenieś 35-milimetrowe naczynie zawierające DRG do okapu laminarnego i umyj DRG trzykrotnie pożywką bez surowicy za pomocą pipety. Użyj sterylnej pęsety, aby przenieść DRG do nowej 35-milimetrowej naczynia hodowlanej zawierającej 2 mililitry sterylnej kolagenazy typu 1A. Umieść tkankę w roztworze kolagenazy w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby rozpocząć dysocjację komórek.

Po inkubacji usuń roztwór kolagenazy i umyj DRG trzy razy w 2 mililitrach zbilansowanego roztworu soli Hanka. Następnie dodaj 2 mililitry wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA do naczynia i trawić DRG w inkubatorze przez 30 minut, tak jak poprzednio. Po roztrawieniu użyj szklanej pipety, aby przenieść 2 mililitry roztworu zawierającego DRG do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

DRG może przykleić się do szklanej pipety, dlatego ten krok należy wykonywać ostrożnie. Strat DRG można uniknąć, trzymając roztwór zawierający DRG w stożkowym końcu szklanej pipety i przenosząc roztwór do probówki wirówkowej powoli, ale bez przerw

Następnie odwiruj roztwór o sile 290 razy g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usuń supernatant i dodaj kolejne 2 mililitry pożywki bez surowicy, aby ponownie zawiesić DRG. Powtórzyć płukanie dwukrotnie, używając 2 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej w celu ponownego zawieszenia tkanki po końcowym odwirowaniu.

Za pomocą wcześniej przygotowanej sterylnej, polerowanej płomieniowo pipety ręcznie rozcierać DRG około 60 razy. Następnie wyjmij z inkubatora CO2 24-dołkową płytkę pokrytą poli-L-lizyną zawierającą 1 mililitr pożywki hodowlanej na dołek. Odessać inkubowaną pożywkę hodowlaną z naczynia.

Wysiej komórki DRG od jednego szczura do czterech studzienek. Daje to gęstość wysiewu około 500 000 komórek na dołek. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną pożywką uzupełnioną 10 mikromolowym AraC i 100 nanogramami na mililitr NGF.