JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:06 min. • July 8th, 2025
Mikrokrwotoki mózgowe (CMH) to neurozapalne krwawienia do mózgu spowodowane przerwaniem bariery krew-mózg, powodujące wyciek czerwonych krwinek lub erytrocytów do tkanki mózgowej.
Aby wykryć CMH, zacznij od utrwalonej tkanki mózgowej szczura z CMH.
Zanurz tkankę w sacharozie w celu krioprotekcji.
Za pomocą kriomikrotomu należy przeciąć tkankę i pobrać wycinek na szkiełko podstawowe.
Umyć, aby usunąć resztki utrwalacza.
Zastosuj barwnik hematoksylinowy związany z kationem metalu, który oddziałuje z ujemnie naładowanym DNA, barwiąc jądro na czerwono-fioletowo.
Następnie nałóż kwaśny alkohol, aby usunąć nadmiar barwnika, a następnie nałóż alkaliczny środek niebieszczący, aby zneutralizować kwaśne środowisko i przekształcić barwnik w jego niebieską formę, zwiększając kontrast.
Umyj chusteczkę alkoholem, aby poprawić penetrację plamy, a następnie nałóż eozynę, aby zabarwić erytrocyty czerwono-pomarańczowe i składniki tkanek na różowo.
Odwodnić tkankę za pomocą zwiększającego stężenia alkoholu i oczyść ją ksylenem w celu uzyskania mikroskopowej wizualizacji.
Uchwyć obrazy, aby wykryć czerwono-pomarańczowe krwinki czerwone, które wyciekły, potwierdzając CMH.
Po wyizolowaniu mózgu zanurz go w 20% sacharozie w PBS na co najmniej sześć godzin lub do momentu, gdy mózg opadnie na dno rurki. Zmień roztwór na 30% sacharozy i napraw go na kolejne sześć godzin.
Na koniec przygotuj skrawki tkanki mózgowej o grubości 10 milimetrów za pomocą kriostatu. Barwienie H&E należy rozpocząć od umycia szkiełek w wodzie destylowanej. Następnie zanurz w roztworze hematoksyliny na osiem minut. Po zabarwieniu myj pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut. Różnicować w 1% kwasowym alkoholu przez 30 sekund.
Po umyciu pod bieżącą wodą z kranu przez minutę zaplamić w 0,2% wodzie amoniakalnej lub nasyconym roztworze węglanu litu przez 30 sekund do jednej minuty. Następnie myj pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut. Barwienie przeciwstawne roztworem eozyny przez 30 sekund do jednej minuty. Odwodnić przez 90% alkoholu, następnie 95% alkoholu i alkohol absolutny przez 0,5 do 2 minut każdy.
Po odwodnieniu należy sklarować ksylen przez 30 sekund. Po zamontowaniu przeanalizuj barwienia H&E za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego jasnego pola. Czerwone krwinki uwalniane z naczyń krwionośnych, które są składnikami CMH, pojawiają się na czerwono-pomarańczowo w barwieniu H&E.