Pomiar poziomu kwasu retinowego w neurosferach za pomocą linii komórkowej reporterowej kwasu retinowego

Weź przylegającą hodowlę komórek reporterowych kwasu retinowego (RZS).

Komórki te są nosicielami transgenicznego konstruktu zawierającego gen lacZ, który koduje β-galaktozydazę, regulowaną przez element odpowiedzi kwasu retinowego (RZADKO).

Nasiona zdysocjowanych komórek pochodzących z neurosfer komórek macierzystych rdzenia kręgowego myszy. Inkubować.

Komórki neurosfery uwalniają RZS, który dostaje się do komórek reporterowych i wiąże się z ich kompleksem receptorowym na RZADKO.

Powoduje to tworzenie się kompleksu aktywatora transkrypcji, inicjując ekspresję β-galaktozydazy.

Zastąp pożywkę utrwalaczem, aby zachować morfologię komórkową.

Usuń utrwalacz i przemyj buforem.

Dodaj bufor przepuszczalny, aby przepuszczalność błon komórkowych.

Wprowadzić substrat β-galaktozydazy i inkubować.

Substrat dostaje się do komórek reporterowych, gdzie β-galaktozydaza hydrolizuje go do niestabilnego produktu, który utlenia się i dimeryzuje, tworząc niebieski osad.

Umyć buforem.

Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję i porównaj ją z krzywą standardową, aby określić ilościowo wydzielanie RZS z komórek neurosfery.

W przypadku kokultur neurosfery zacznij od przeniesienia kultury neurosfery