JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:10 min. • July 8th, 2025
Weźmy wycinek kory mózgowej z transgenicznego mózgu myszy, który wyraża aktywowane światłem kanały kationowe w pobudzających neuronach piramidowych kory mózgowej.
Zabezpiecz plasterek w komorze rejestracyjnej i przeprowadź go za pomocą sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego, aby utrzymać żywotność tkanek.
Włóż elektrodę rejestrującą do powierzchownej warstwy kory mózgowej i zarejestruj podstawową aktywność neuronalną.
Wprowadź lek wywołujący drgawki, który blokuje kanały potasowe bramkowane napięciem, zapobiegając odpływowi potasu i utrzymując neurony w stanie nadpobudliwości.
Nadpobudliwe neurony spontanicznie generują wybuchy potencjałów czynnościowych, zwane zdarzeniami ictal, przez dłuższy czas.
Aby wygenerować zdarzenia ictal na żądanie, zastosuj krótki impuls świetlny, aby aktywować kanały kationowe na pobudzających neuronach piramidowych.
Wynikający z tego napływ kationów generuje potencjały czynnościowe, wyzwalając uwalnianie neuroprzekaźników pobudzających.
Te neuroprzekaźniki wiążą się z receptorami na neuronach postsynaptycznych, powodując napływ kationów.
Napływ powoduje wybuchy potencjału czynnościowego, generując zdarzenia ictal na krótki czas.
W tej procedurze wytnij papier do soczewek, który jest nieco większy niż plasterek mózgu. Użyj pipety o szerokim otworze lub szczoteczki do detali, aby przenieść plasterek mózgu na wycięty papier do soczewek, który jest przytrzymywany za pomocą pęsety dentystycznej. Następnie przenieś papier do soczewek z plastrem mózgu do komory nagraniowej i zabezpiecz go na miejscu za pomocą sitka harfowego.
Następnie należy perfaktorować wycinek mózgu w komorze rejestracyjnej karbogenicznym ACSF w temperaturze 35 stopni Celsjusza, z szybkością trzech mililitrów na minutę. Użyj termometru cyfrowego, aby upewnić się, że komora zapisu ma od 33 do 36 stopni Celsjusza. Następnie wypełnij szklane elektrody 10 mikrolitrami ACSF za pomocą strzykawki Hamiltona.
Pod 20-krotnym mikroskopem stereoskopowym wprowadź szklaną elektrodę rejestrującą do powierzchownej warstwy korowej 2/3 za pomocą ręcznych manipulatorów. Przeglądaj aktywność elektryczną wycinka mózgu za pomocą standardowego oprogramowania. Aby wywołać czynności podobne do napadów elektrograficznych, należy perfuzjować wycinek mózgu za pomocą ACSF zawierającego 4-AP w odległości 100 mikromolowców. Przeglądaj aktywność elektryczną wycinka mózgu za pomocą standardowego oprogramowania.
Aby wygenerować elektrograficzne zdarzenia podobne do napadów przy użyciu strategii optogenetycznej na wycinkach mózgu myszy optogenetycznych, użyj ręcznego manipulatora, aby umieścić światłowód o średnicy rdzenia 1,000 mikronów bezpośrednio nad obszarem nagrywania. Zastosuj krótki impuls niebieskiego światła, aby zainicjować zdarzenie ictal.